黃芪化學成分抗纖維化作用及分子機制研究進展

王佳俊，向世勰，謝治深，王潘，苗晉鑫，張振強，張效威，徐江雁（河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州 450046）

纖維化是指多類型的組織損傷，尤其是在慢性炎癥反應(yīng)性疾病過程中，組織修復(fù)平衡失調(diào)導(dǎo)致膠原蛋白、纖維連接蛋白和細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）成分持續(xù)積累，進而導(dǎo)致組織中纖維結(jié)締組織異常增生的動態(tài)過程。其特征為成纖維細胞活化，ECM 異常增多、過度沉積。多種因素可引起纖維化，包括炎癥感染、自身免疫性疾病、退行性疾病、腫瘤等[1-4]。纖維化雖不是具體的疾病，但可發(fā)生于任何組織器官的疾病中，其持續(xù)進展會導(dǎo)致器官功能障礙和衰竭，因纖維化相關(guān)疾病引起的死亡人數(shù)約占總死亡人數(shù)比例的45%[5-6]。目前纖維化的臨床防治仍面臨諸多難題，如纖維化難以早期發(fā)現(xiàn)、耐藥性及藥物的毒副作用等[7]。根據(jù)纖維化的癥狀和體征，中醫(yī)將其歸屬為“絡(luò)病”的范疇[8]。王永炎院士[9]提出絡(luò)病發(fā)生的生物學基礎(chǔ)與血管活性物質(zhì)平衡的調(diào)控、ECM 代謝異常、細胞因子及信號傳導(dǎo)通路調(diào)控異常等多種因素有關(guān)。牛建昭等[8]提出氣虛、絡(luò)脈失養(yǎng)、血瘀等因素是纖維化等絡(luò)病發(fā)生的病機。姚寧順等[10]認為腎間質(zhì)纖維化的病機為“久病在絡(luò)，氣血皆塞”，指出虛滯、瘀阻和脈絡(luò)損傷是其常見機理。黃芪自古以來就常被用于損傷性疾病的修復(fù)和各種慢性虛弱證的治療，與上述纖維化的診療思路吻合。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.]的根，味甘，性微溫，入脾、肺經(jīng)，是常用補氣中藥，具有益氣升陽、生津養(yǎng)血、托毒排膿、斂瘡生肌等功效[11]。黃芪首載于《五十二病方》：“[肉]?。ň遥倍]黃蓍”[12]；《本草綱目》載：“味甘微溫，主癰疽久敗創(chuàng)，排膿止痛，……補虛”；李時珍贊其為“補藥之長”[13]；《名醫(yī)別錄》中言：“逐五臟間惡血，補虛損，五勞羸弱，益氣”[14]；張元素在《藥類法象》中言：“黃蓍，補肺氣、入皮毛，……脾胃虛弱，瘡瘍血脈不行，內(nèi)托陰證瘡瘍，必用之”[15]，均表明黃芪具有較好的補氣功效，且與抗纖維化的病機理論相契合，可用于防治纖維化。黃芪含有多糖類、皂苷類、黃酮類、氨基酸等化學成分和微量元素[8-11]，這些成分具有多種藥理活性，包括抗炎、抗纖維化、調(diào)節(jié)血糖血壓、抗衰老以及抗氧化應(yīng)激等。黃芪及其有效成分抗纖維化作用及機制的相關(guān)研究成為眾多學者關(guān)注的焦點[16-18]。因此，本文對其抗纖維化的作用及其機制進行綜述。

1 化學成分

黃芪含有皂苷類、多糖類、黃酮類、氨基酸、微量元素、維生素等多種化學成分。

1.1 皂苷類皂苷類是黃芪的主要成分，包括黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，酰基黃芪皂苷，大豆皂苷和異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等[19-20]。黃芪皂苷類具有抗衰老、抗炎、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種活性[21-23]。

1.2 多糖由淀粉糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖糖醛酸和鼠李糖等單糖組成的黃芪多糖是一種高分子糖類物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗纖維化、抗衰老、抗腫瘤等藥理作用[24-25]。

1.3 黃酮類黃芪中的黃酮類化合物包括槲皮素、沙苑子苷、山柰黃素、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、異黃烷、異鼠李素等[26-30]，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗纖維化等作用[21-28]。

1.4 其他黃芪還含有多種氨基酸、微量元素、維生素，以及阿魏酸、香草酸、蔗糖、葉酸、香豆精、亞油酸、亞麻酸等成分[31-32]。

2 黃芪活性成分抗纖維化的藥理作用及分子機制

2.1 防治腎纖維化腎纖維化是一種慢性腎臟疾病，由腎組織受損、高血壓、感染等多種因素引起[33]。該病的主要特征為炎癥、腎小管及腎小球區(qū)域?qū)嵸|(zhì)細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、基底膜異常增厚、ECM 成分持續(xù)累積等，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)受損以及生理功能喪失[34]。

研究發(fā)現(xiàn)，多條信號通路在腎纖維化進展過程中發(fā)揮著重要的作用。Wnt/β連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路廣泛參與細胞黏附、遷移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）、胚胎發(fā)育以及組織和器官穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等生命過程，其異常激活可誘導(dǎo)成纖維細胞活化、促進纖連蛋白的表達、加速腎臟纖維化進程[31，35-36]。Wang 等[37]證實黃芪甲苷能濃度依賴性地下調(diào)單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎纖維化模型大鼠腎臟組織中的β-catenin、Wnt4 蛋白的表達，抑制Wnt/βcatenin 通路的過度激活，從而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/Smad 信號通路是參與纖維化調(diào)控的經(jīng)典信號通路。TGF-β 與細胞膜上的TGF-βR2 受體結(jié)合，招募TGF-βR1 形成復(fù)合體，進一步影響下游Smad2/3的活性，調(diào)控多個纖維化指標如膠原蛋白、纖連蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達，最終促進腎臟組織纖維化的發(fā)生[38]。多種黃芪有效成分可通過調(diào)控TGF-β/Smad 信號通路發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用[39-40]。Wang等[39]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷通過抑制TGF-β/Smad 信號通路，降低Smad2/3 磷酸化水平，激活TGF-β/Smad 通路的抑制型（Smad7），進而抑制結(jié)締組織生長因子以及肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達。此外，黃芪多糖也能夠調(diào)節(jié)TGF-β/Smad 信號通路，減少ECM 積聚，改善糖尿病腎臟疾病小鼠的腎臟纖維化[41-43]。

黃芪有效成分可通過調(diào)控纖維化相關(guān)因子如TGF-β1 來發(fā)揮防治腎臟纖維化的作用。TGF-β1 可促進膠原蛋白和纖連蛋白的生成和異常沉積，導(dǎo)致上皮細胞和間質(zhì)細胞中相關(guān)纖維化蛋白的增加，加速腎臟纖維化的發(fā)生與發(fā)展[38，44-45]。Zheng等[46]實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)TGF-β1，降低下游蛋白激酶整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）的活性，緩解醋酸脫氧皮質(zhì)酮-高鹽和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠腎功能損傷，降低血肌酐、尿素氮和尿酸水平，并抑制白細胞介素1β、白細胞介素6、α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的表達，減輕炎癥反應(yīng)，進而抑制腎臟纖維化的發(fā)展。

過度的細胞凋亡也是促進腎臟纖維化發(fā)生的重要因素。p38/MAPK 等信號通路異常激活可上調(diào)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程，以誘導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致腎臟纖維化[47]。Xu等[48]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠通過抑制p38/MAPK 通路介導(dǎo)的細胞凋亡，劑量依賴性地降低UUO小鼠腎組織中TGF-β1、α-SMA、Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白等蛋白的表達，減少腎組織ECM 的沉積，發(fā)揮抑制腎臟纖維化的作用。

2.2 防治肝纖維化肝纖維化指肝臟損傷后修復(fù)過程中ECM 的彌漫性過度沉積與異常分布所導(dǎo)致的病理性修復(fù)反應(yīng)，可由非酒精性脂肪性肝炎、乙型和丙型肝炎等多種慢性肝損傷性疾病引起[49-51]，其進一步發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化甚至肝功能衰竭[52-53]。在肝組織的慢性損傷、炎癥和修復(fù)過程中ECM 各組分生成增加、降解減少，導(dǎo)致包括纖連蛋白、蛋白多糖和膠原等成分在肝內(nèi)過量沉積，促使α-SMA 等間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的異常上調(diào)，最終形成肝纖維化[49-50]。

在肝纖維化進展的過程中，EMT 表現(xiàn)為上皮細胞轉(zhuǎn)化成具有間充質(zhì)特征的細胞，使纖維化相關(guān)分子表達、膠原合成和ECM 沉積增加。E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和α-SMA 等是EMT 的主要標志物[52-54]。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可抑制EMT 的發(fā)生，其通過上調(diào)肝組織內(nèi)E-鈣黏蛋白，下調(diào)TGF-β1、α-SMA 和N-鈣黏蛋白，改善四氯化碳（CCL4）誘導(dǎo)的模型大鼠的肝纖維化。此外，黃芪多糖也被證實可通過抑制EMT，下調(diào)α-SMA、膠原和層黏連蛋白的表達，減輕ECM 過度沉積，改善CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型的病理損傷[54-55]。

炎癥反應(yīng)在肝纖維化進展過程中發(fā)揮著重要作用。炎癥反應(yīng)發(fā)生時，炎癥細胞（如巨噬細胞、淋巴細胞）和纖維母細胞等浸潤和激活，進一步誘發(fā)炎癥介質(zhì)如細胞因子、趨化因子等的釋放。炎癥介質(zhì)可誘導(dǎo)肝臟組織中成纖維細胞異常增殖、膠原合成和ECM 沉積，進而促進肝纖維化的發(fā)展。因此，減輕肝臟炎癥反應(yīng)是干預(yù)肝臟纖維化的重要策略之一[53，56]。李艷等[57]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總黃酮通過減輕肝臟炎癥反應(yīng)、抑制TGF-β1/Smad 信號通路的激活以及纖維化相關(guān)指標的表達，進而改善CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝臟纖維化。此外，有研究[58]發(fā)現(xiàn)，黃芪黃酮類化合物（如芒柄花素、異鼠李素、山柰酚、毛蕊異黃素等）能夠針對性地阻斷核轉(zhuǎn)錄因子（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在肝纖維化模型中表現(xiàn)出抗炎作用，進而抑制肝星狀細胞（Hepatic Stellate Cells，HSCs）的活化并減少ECM在HSC-T6細胞內(nèi)的沉積。

HSCs 作為最重要的ECM 分泌細胞之一，在纖維化過程中起著關(guān)鍵的作用。肝纖維化可抑制HSCs 的細胞凋亡，導(dǎo)致促纖維化因子和ECM 成分增多，進而促進成纖維細胞的活化和膠原蛋白的合成，推動肝纖維化的進展[49，51，53]。Chen 等[59]實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能上調(diào)血小板衍生生長因子激活的大鼠HSC-T6細胞模型中衰老標志物（高遷移率族蛋白A1、p21 和p53），增加了衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的活性，使活化的HSC-T6細胞中纖維化相關(guān)標志物collagenⅠ、α-SMA 和纖連蛋白等下調(diào)，表明黃芪甲苷可通過促進HSCs細胞凋亡，減輕肝臟纖維化。

2.3 防治肺纖維化肺纖維化是一種進行性慢性間質(zhì)性肺部疾病，特征是肺組織中纖維組織增生和瘢痕形成。其發(fā)病與遺傳易感性、持續(xù)性損傷、衰老、氧化應(yīng)激等多種因素有關(guān)。肺成纖維細胞的異?；罨CM 的過度沉積以及肺部瘢痕的形成是肺纖維化的主要臨床病理特征，隨著時間的推移，肺纖維化會逐漸擴展并且無法逆轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致呼吸困難和肺功能衰竭[60-61]。

多種信號通路如雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）和磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，Akt）等，其異常激活或失調(diào)與肺纖維化異常的細胞增殖和過度的膠原沉積有關(guān)。mTOR信號通路可調(diào)節(jié)肺纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，其效應(yīng)分子磷酸化核糖體蛋白S6（phosphorylated S6 ribosomal protein，p-S6）表達升高能夠反映該通路的活化[64]。黃芪多糖能夠抑制肺纖維化大鼠肺組織中mTOR 及其下游p-S6 的表達，降低肺纖維化間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白α-SMA 的表達水平，發(fā)揮保護肺臟的作用[62]。此外，活化的PI3K 通過招募并磷酸化促進Akt 參與纖維化進程，異常激活的PI3K/Akt 通路促進纖維細胞增殖和轉(zhuǎn)分化、炎癥反應(yīng)和纖維化相關(guān)因子，導(dǎo)致過度的膠原沉積和纖維化[61，63]。黃芪甲苷可抑制TGF-β1/PI3K/Akt 通路，降低TGF-β1 的表達水平，并抑制Akt 蛋白激酶的磷酸化，從而抑制EMT 的發(fā)生，在博萊霉素（Bleomycin，BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)揮著顯著的抗纖維化作用[64]。

黃芪化學成分能夠通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）發(fā)揮抑制纖維化的作用。欒智華等[65]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF/VEGF受體2（VEGFR2）信號通路具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和分化的作用，進而導(dǎo)致血管異常增生，為纖維化過程中活化的成纖維細胞提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，是促進肺纖維化進展的重要因素。黃芪甲苷可通過調(diào)控VEGF/VEGFR2 信號通路，顯著降低鼻腔滴注BLM 建立的肺纖維化小鼠模型中VEGF 和VEGFR2基因表達來抑制異常血管增生，減少成纖維細胞的增殖和合成膠原，發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

在肺纖維化中，炎癥反應(yīng)起著重要的作用。肺部受到損傷或刺激后，經(jīng)典炎癥通路NF-κB 異?；罨?，增加炎癥因子的表達，加劇炎癥反應(yīng)促進肺纖維化的發(fā)生[64]。Zhang 等[66]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有降低NF-κB 通路活性的作用，從而抑制EMT 的發(fā)生和進展，減少膠原、α-SMA 生成以及ECM 過度沉積，增加E-鈣黏蛋白水平，具有抗肺纖維化的作用。

2.4 防治心肌纖維化心肌纖維化的發(fā)生與多種心血管疾病如高血壓、心肌梗死、心力衰竭等有關(guān)，其主要特征為心肌組織中膠原沉積增加、纖維組織增生、心肌細胞肥大以及心臟結(jié)構(gòu)的重塑[67-68]。心肌纖維化會導(dǎo)致心肌彈性和收縮功能下降、心臟舒張功能受限及心律失常，加重心功能障礙，最終可導(dǎo)致心力衰竭[69-71]。

TGF-β1/Smad信號通路異常激活是心肌纖維化發(fā)生的重要原因之一，其通過調(diào)節(jié)相關(guān)纖維化基因表達，導(dǎo)致膠原合成以及ECM 累積增加，促進心肌纖維化發(fā)生和發(fā)展[71-72]。黃芪甲苷通過調(diào)控TGF-β1/Smad 信號通路可抑制心肌纖維化的進展[73]。Chen等[74]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷通過抑制柯薩奇病毒B3（Coxsackie virus type B3，CVB3）誘導(dǎo)的心肌病中的TGF-β1/Smad 信號通路，降低膠原水平，從而改善心肌纖維化。此外，黃芪多糖也被證實具有降低TGF-β1 表達，抑制Smad2/3 激活和減少膠原纖維生成的作用，從而改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化[25，70]。另外，黃芪總皂苷能夠減輕低劑量X線照射引起的心肌成纖維細胞損傷，抑制心肌成纖維細胞異常合成和分泌ECM，且降低了心肌成纖維細胞中TGF-β1和p-Smad2/3的表達水平，從而抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活，發(fā)揮抗放射性治療引起的心臟纖維化作用[75-76]。

心肌細胞凋亡與心臟纖維化的病理過程密切相關(guān)，抑制與細胞凋亡相關(guān)的信號通路可以改善心肌損傷和纖維化[71，77]。在CVB3 誘導(dǎo)的病毒性心肌炎模型中，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)as）/脂肪酸合成酶配體（Fatty acid synthase ligand，F(xiàn)asL）介導(dǎo)的細胞凋亡通路被激活，進而激活caspase 家族蛋白（caspase-8和caspase-3等），導(dǎo)致心肌細胞凋亡的發(fā)生。過度的心肌細胞凋亡引發(fā)炎性反應(yīng)，破壞正常心肌結(jié)構(gòu)和功能，加劇纖維化進程。黃芪甲苷可以抑制心肌細胞中促凋亡基因Fas、FasL的表達，同時下調(diào)caspase-8和caspase-3的活性，從而降低心肌細胞凋亡。這種抑制作用不僅提高小鼠存活率，也對心肌纖維化損傷起到保護作用[78]。

心肌細胞的炎癥反應(yīng)在心臟纖維化過程中起重要作用。心肌細胞受到病原體感染或發(fā)生損傷后，通過釋放炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α和IL-1β等激活免疫細胞而引發(fā)炎癥反應(yīng)，進而激活成纖維細胞，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂欣w維化活性狀態(tài)，并增加膠原合成和ECM沉積[71-72]。已有研究[79]證實，毛蕊異黃酮能夠通過下調(diào)磷酸化IκB激酶α/β、磷酸化NF-κB和腫瘤壞死因子α 的表達，從而減輕心肌細胞炎癥反應(yīng)，抑制I型和III型膠原的表達和沉積，改善心肌纖維化，發(fā)揮心臟的保護作用。

2.5 其他腹膜上皮細胞EMT是腹膜纖維化的關(guān)鍵過程，腹膜纖維化容易進一步發(fā)展為包裹性腹膜硬化癥。黃芪甲苷可通過促進Smad7 的表達，抑制TGFβ1 誘導(dǎo)的EMT，從而發(fā)揮抗腹膜纖維化的作用[80]。系統(tǒng)性硬化癥是一種以免疫失調(diào)、血管病變和進行性皮膚及內(nèi)臟器官纖維化為特征的自身免疫性疾病。黃芪多糖能夠抑制BLM 誘導(dǎo)的硬皮病小鼠模型皮膚過度纖維增生和膠原沉積[25，81]。此外，黃芪甲苷可以調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2/3 信號通路，降低p-Smad3的水平并阻止其向核內(nèi)移位，從而抑制膠原蛋白和纖連蛋白的表達，改善纖維化癥狀，進而發(fā)揮防治系統(tǒng)性硬化癥的作用[82]。

3 討論

黃芪被廣泛應(yīng)用于纖維化的治療，在防治臟器纖維化的進程中發(fā)揮著重要的作用。當前黃芪的抗纖維化的研究主要集中在TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、VEGF/VEGFR2、NF-κB 和mTOR 等信號通路，其有效成分可通過參與抗炎、抑制ECM 沉積、抑制EMT 過程、調(diào)控纖維化相關(guān)因子以及調(diào)控凋亡等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮著抗纖維化作用。然而，有關(guān)黃芪在信號通路中的具體作用靶點報道較少，有必要深入探索黃芪的潛在治療機制和具體治療靶點。同時，目前黃芪抗纖維化各種作用機制之間的協(xié)同或拮抗作用的研究較少，需要進一步深入探討。目前，黃芪抗纖維化研究多集中在多糖類、皂苷類和黃酮類等，對其他活性成分的研究相對較少，有待進一步開展相關(guān)研究。

為了更好地揭示黃芪在抗纖維化中的作用機制，可以利用基因組學、蛋白質(zhì)組學和生物信息學等方法系統(tǒng)地鑒定黃芪中不同成分的潛在靶點，并通過信號調(diào)控分析揭示黃芪在抗纖維化中的分子作用機制。此外，可通過修飾和調(diào)整黃芪中活性成分的結(jié)構(gòu)，評估不同結(jié)構(gòu)類似物對纖維化治療靶點的選擇性和親和性，以確定潛在的藥物靶點并優(yōu)化治療效果。本課題組正在開展對黃芪活性成分的抗纖維化及其作用機制的相關(guān)研究。用熒光素酶報告基因篩選方法，在模擬纖維化的細胞模型中發(fā)現(xiàn)了具有保護作用的活性成分。同時，采用計算機輔助藥物設(shè)計方法，如分子對接和虛擬篩選，預(yù)測了黃芪中成分與已知抗纖維化靶點之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)黃芪活性成分可能主要通過參與表觀遺傳學相關(guān)通路來發(fā)揮抗纖維化作用，對黃芪抗纖維化研究和應(yīng)用具有重要意義。