RASSF10基因在賁門腺癌組織中的甲基化狀態(tài)及表達

河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011

RASSF10基因在賁門腺癌組織中的甲基化狀態(tài)及表達

崔建利 郭煒 郭艷麗 沈素朋 董稚明

河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011

背景與目的：Ras相關域家族10基因(Ras-association domain family 10，RASSF10)在多種腫瘤組織中具有腫瘤抑制功能，然而在賁門腺癌組織中的研究尚未見報道。檢測賁門腺癌(gastric cardia adenocarcinoma，GCA)組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)及表達情況，進一步探討RASSF10基因在GCA發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法：分別應用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)及免疫組織化學方法檢測81例GCA患者癌組織及癌旁正常組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)及mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果：RASSF10基因在GCA組織中的啟動子區(qū)甲基化率(64.2%，52/81)顯著高于癌旁正常組織(21.0%，17/81，P＜0.05)，并與腫瘤組織的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P均＜0.05)。RASSF10基因在GCA組織中的mRNA表達量(0.57±0.05)顯著低于癌旁正常組織(0.78±0.02，P＜0.05)，并與腫瘤組織的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P均＜0.05)。RASSF10蛋白在GCA組織中的陽性表達率(31.1%，26/81)明顯低于癌旁正常組織(71.6%，58/81，P＜0.05)，并與腫瘤組織的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P均＜0.05)。RASSF10基因在GCA組織中的甲基化率與其蛋白表達呈明顯的負相關。結(jié)論：RASSF10基因啟動子區(qū)的異常高甲基化導致的基因沉默可能是GCA發(fā)生的機制之一。

賁門腺癌；甲基化；RASSF10基因

賁門癌是發(fā)生于賁門黏膜上皮及腺體的癌，主要指原發(fā)于或占據(jù)于胃食管交接處以下2 cm內(nèi)的腫瘤，主要組織學類型是腺癌［1］。以往賁門癌常被列入食管癌或胃癌，近年隨著病理診斷技術及內(nèi)鏡篩查方法的不斷改進而將其獨立出來，其發(fā)病部位與Barrett食管接近，其形態(tài)學、病因、治療和預防均不同于胃遠端腺癌，臨床癥狀隱匿，絕大多數(shù)患者確診時已屬中晚期，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。由于其部位的特殊性，及表型、生長方式、組織學、細胞分化等方面具有多樣性的特征，近年來受到越來越多研究者的關注［2］。然而其發(fā)病機制尚未完全明確，因此，明確其發(fā)生、發(fā)展的分子機制對于早期檢測及治療顯得尤為重要。Ras相關域家族(Ras-association domain family，RASSFs)共包含10個成員，RASSF1-RASSF10、RASSF1-6為經(jīng)典家族成員，RASSF7-10為N-端家族成員［3］。RASSF10基因?qū)儆贜-端家族成員之一，編碼N-端RA相關域，缺乏經(jīng)典家族成員特有的Sav-Ras-Hippo(SARAH)作用域。該基因為單一外顯子基因，編碼507個氨基酸，定位于染色體11p15.2，位置上靠近RRAS2基因［4］。研究表明RASSFs成員在多種實體腫瘤組織中發(fā)生表觀遺傳失活。目前，有關RASSF10基因在(gastric cardia adenocarcinoma，GCA)組織中的研究還尚未報道。本研究檢測了組織中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)及表達情況，旨在探討其在GCA發(fā)生、發(fā)展中的作用，以便探究GCA發(fā)生的表觀遺傳學機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

蛋白酶K、甲基化酶SssⅠ購自Merck公司，DNA純化試劑盒、藍色體系、購自Promega公司。TRIzol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自Fomentas公司，綠色體系購自Promega公司。所有引物均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。RASSF10兔抗人多克隆抗體、免疫組織化學SP試劑盒、DAB顯色劑購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。

1.1.2 標本

收集河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院2011年9月—2012年9月間的GCA手術患者，共81例，其中男性50例，女性31例，年齡37～75歲，中位年齡58歲，所有患者術前均未給予任何放療與化療，標本及其資料的收集均經(jīng)患者本人簽署知情同意書，且該研究經(jīng)當?shù)貍惱砦瘑T會批準。標本取自賁門腺癌原發(fā)灶及相應癌旁正常組織(距離原發(fā)灶邊緣2 cm以上)。手術切除所采集的標本，一部分用4%中性甲醛溶液固定，用于常規(guī)石蠟包埋，行免疫組織化學染色。另一部分用液氮保存，用于DNA和RNA提取，行甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)和RTPCR檢測。所有標本均經(jīng)3位資深病理醫(yī)師通過HE染色確診。按腫瘤病理學分級，高分化25例(30.9%)，中分化10例(12.3%)，低分化46例(56.8%)。按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標準進行TNM分期：Ⅰ期10例(12.4%)，Ⅱ期56例(69.0%)，Ⅲ期10例(12.4%)，Ⅳ期5例(6.2%)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例。

1.2 方法

1.2.1 MSP方法檢測RASSF10基因CpG島的甲基化狀態(tài)

每個標本均取10 μm石蠟切片約15片，經(jīng)蛋白酶K消化后，運用酚/氯仿抽提法提取GCA組織及相應癌旁正常組織中的DNA，取2 μg DNA標本進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換，依照DNA純化試劑盒步驟進行純化。通過亞硫酸氫鹽處理后，單鏈DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)可脫去氨基轉(zhuǎn)為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶在甲基的保護作用下不能轉(zhuǎn)為尿嘧啶。運用MethPrimer對RASSF10基因CpG島的分布情況進行在線預測并結(jié)合亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換的原理分別設計相應引物(圖1)，以檢測RASSF10基因的甲基化狀態(tài)，引物、退火溫度見表1。反應條件為: 95 ℃預變性10 min；95 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)后，72 ℃終延伸7 min。將擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，用UV凝膠電泳成像儀進行圖像分析。陽性對照為甲基化酶SssⅠ處理基因組DNA進行PCR，陰性對照為滅菌雙蒸水替代DNA模板進行PCR。隨機選擇10%標本進行重復以保證MSP的可靠性。

1.2.2 RT-PCR的方法檢測RASSF10 mRNA的表達

取凍存組織每例大約100 mg剪碎研磨，按TRIzol試劑說明提取RNA，并測定濃度及純度。嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參照，引物、退火溫度見表1。反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)后，72 ℃終延伸7 min。將擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳。利用Gel work-2ID軟件，對電泳圖像中RASSF10基因mRNA表達水平進行半定量研究。以RASSF10基因條帶的吸光度值和GAPDH條帶的吸光度值的比值表示RASSF10基因mRNA的相對表達水平。實驗重復3次，取平均值。

圖1 RASSF10基因CpG島分布及MSP引物位置Fig. 1 CpG islands of RASSF10 gene and the location of primer for MSP

表1 RASSF10基因RT-PCR、MSP引物及反應條件Tab. 1 Primer sequences and reaction conditions of RT-PCR and MSP for RASSF10 gene

1.2.3 免疫組織化學方法檢測RASSF10蛋白表達

組織經(jīng)脫水、包埋后每例常規(guī)3 μm連續(xù)切片，平貼于防脫載玻片上，置60 ℃烤箱中2 h備用。采用SP法，切片常規(guī)脫蠟，過氧化氫/甲醇溶液滴加于組織，室溫避光修復20 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，EDTA緩沖液高壓鍋抗原熱修復4 min。滴加一抗(稀釋比例為1∶100)，在4 ℃冰箱中過夜。次日依次滴加二抗和三抗試劑，顯微鏡下DAB顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素細胞核復染，逐級脫水，透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗作為空白對照，余步驟同上。正常胃黏膜組織為陽性對照。RASSF10蛋白以細胞核中出現(xiàn)棕褐/棕黃色顆粒為陽性表達，判定標準［5］：按照多數(shù)陽性細胞的染色強度列為4個等級：無顯色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。鏡下陽性細胞數(shù)所占比例≤25%為0分；26%～50%為1分；51%～75%為2分；＞75%為3分。將以上兩項得分相加：0分記為“-”，1～2分記為“+”，3～4分記為“++”，5～6分記為“+++”。其中“++”、“+++”為陽性表達，“-”、“+”為陰性表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。MSP及免疫組化實驗結(jié)果與臨床病理資料間的關系采用χ2和校正χ2檢驗的統(tǒng)計方法，RT-PCR與臨床病理資料及MSP間的關系采用t檢驗和近似t檢驗，MSP與免疫組化間的關系采用χ2檢驗及Spearman相關性分析的統(tǒng)計方法。以上均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 RASSF10基因在GCA中的甲基化狀態(tài)

全部81例GCA組織及癌旁正常組織均成功進行了MSP檢測(圖2)。結(jié)果顯示，RASSF10基因啟動子區(qū)在GCA組織和癌旁正常組織中的甲基化率分別為64.2%(52/81)和21.0%(17/81)，GCA組織中RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P=0.010)。分組分析發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率(76.3%，29/38)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(53.5%，23/43，χ2=4.574，P=0.032)；Ⅲ、Ⅳ期組甲基化發(fā)生率(86.7%，13/15)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組(59.1%，39/66，χ2=4.044，P=0.044)；低分化組甲基化發(fā)生率(87.0%，40/46)明顯高于高、中分化組(34.3%，12/35，χ2=23.991，P=0.000)；年齡＜60歲組的甲基化發(fā)生率為65.3%(32/49)，≥60歲組的甲基化發(fā)生率為62.5%(20/32)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.066，P=0.797)；男性組的甲基化發(fā)生率為64.0%(32/50)，女性組的甲基化發(fā)生率為64.5%(20/31)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.002，P=0.962，表2)。

圖2 GCA中RASSF10基因的甲基化狀態(tài)Fig. 2 Methylation analysis of RASSF10 gene in GCA tissues

表2 GCA組織中RASSF10基因的mRNA和蛋白表達、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料之間的關系Tab. 2 The relationship between mRNA, protein expression, methylation status of RASSF10 gene and GCA clinical pathological data

2.2 RASSF10基因mRNA在GCA組織中的表達

在81例GCA組織及相應癌旁正常組織中檢測了RASSF10基因mRNA的表達(圖3)。GCA組織中RASSF10基因mRNA的相對表達量(0.57±0.05)顯著低于癌旁正常組織(0.78±0.02)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-36.940，P=0.000)。分組分析發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的RASSF10基因mRNA相對表達量(0.55±0.04)顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.58±0.05，t=-2.512，P=0.014)；Ⅰ、Ⅱ期RASSF10 mRNA相對表達量(0.57±0.04)顯著高于Ⅲ、Ⅳ期RASSF10 mRNA相對表達量(0.53±0.05，t=4.086，P=0.000)；高、中分化組RASSF10 mRNA的相對表達量為0.58±0.06，低分化組RASSF10 mRNA相對表達量為0.56±0.04，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.711，P=0.092)；年齡＜60歲組的相對表達量為0.56±0.05，年齡≥60歲組的相對表達量為0.57±0.04，差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.308，P=0.759)；男性組的相對表達量為0.56±0.04，女性組的相對表達量為0.57±0.05，差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.087，P =0.280，表2)。

圖3 GCA及癌旁正常組織中RASSF10基因的mRNA表達Fig. 3 mRNA expression of RASSF10 gene in GCA and corresponding normal tissues

2.3 RASSF10在GCA組織中的蛋白表達

81例GCA組織中有26例RASSF10蛋白表達呈陽性，其陽性率為32.1%；相應癌旁正常賁門組織中58例RASSF10蛋白表達呈陽性，陽性率為71.6%，GCA組織RASSF10蛋白陽性率顯著低于癌旁正常組織(χ2=0.167，P=0.048，圖4)。RASSF10蛋白在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率(44.2%，19/43)顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率(18.4%，7/38，χ2=6.144，P=0.013)；Ⅰ、Ⅱ期RASSF10蛋白陽性率為37.9%(25/66)，顯著高于Ⅲ、Ⅳ期的6.7%(1/15，χ2=5.463，P=0.019)；高、中分化組RASSF10蛋白陽性率(71.4%，25/35)顯著高于低分化組(2.2%，1/46，χ2=43.739，P=0.000)；年齡＜60歲組的RASSF10的蛋白陽性率為30.6%(15/49)，≥60歲組的蛋白陽性率為34.4%(11/32)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.126，P=0.723)；男性組的RASSF10蛋白陽性率為28.0%(14/50)，女性組蛋白陽性率為38.7%(12/31)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.007，P=0.316，表2)。

2.4 RASSF10基因甲基化與表達之間的相關性

在RASSF10蛋白表達陽性的GCA組織中，其mRNA相對表達量為0.59±0.04，而在RASSF10蛋白表達陰性的GCA組織中，其mRNA相對表達量為0.55±0.04，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.266，P=0.000)。在RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化陽性的GCA組織中，其mRNA相對表達量為0.56±0.04，甲基化陰性的GCA組織中mRNA相對表達量為0.58±0.05，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.507，P=0.014)。發(fā)生RASSF10基因啟動子區(qū)高甲基化的GCA組織中RASSF10蛋白陽性表達率為9.6%(5/52)，RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化陰性組的RASSF10蛋白表達陽性率為72.4%(21/29)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=33.686，P=0.000，表3)。RASSF10基因啟動子區(qū)甲基化與其蛋白表達之間呈負相關(P=0.000)。

圖4 賁門組織中RASSF10蛋白的表達Fig. 4 Protein expression of RASSF10 in gastric cardia tissue

表3 GCA組織中RASSF10基因甲基化與mRNA和蛋白表達之間的關系Tab. 3 The relationship between methylation status and mRNA, protein expression of RASSF10 in GCA tissues

3 討 論

除多基因改變以外，表觀遺傳機制，尤其是DNA甲基化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，啟動子區(qū)CpG島的甲基化可改變癌癥相關基因的表達水平，從而調(diào)節(jié)參與癌細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的信號通路［6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)Ras蛋白可以通過與RASSF家族效應因子相互作用來調(diào)節(jié)多條信號通路影響細胞活動。據(jù)報道某些RASSFs成員(RASSF1A、RASSF2、RASSF4和RASSF5A)在多種類型的實體腫瘤中由于其啟動子區(qū)CpG島甲基化而發(fā)生表觀遺傳學失活［3,7］。

作為表觀遺傳學重要作用機制的DNA甲基化是惡性腫瘤發(fā)病的基本事件之一。腫瘤抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化引起的表達缺失，可導致其失去對腫瘤細胞生長的負性調(diào)控作用［8］。有研究報道RASSF10基因在白血?。?］、甲狀腺癌［10］、膠質(zhì)母細胞瘤［11］、皮膚黑色素瘤［12］、前列腺癌［13］、胃癌［14］和食管鱗癌［15］中發(fā)生高度甲基化。然而，RASSF10基因在GCA中的甲基化狀態(tài)及表達尚未見報道。目前檢測DNA甲基化常見的方法主要有酶切法、直接測序法、MSP等，MSP與其他方法相比避免了使用限制性內(nèi)切酶，敏感性高，簡便易行，適用于大樣本檢測，但存在一定假陽性結(jié)果，適當提高退火溫度可降低假陽性率，從而提高其特異度，為檢測DNA甲基化較為可信的方法。本研究通過MSP的方法發(fā)現(xiàn)RASSF10在賁門腺癌組織中的啟動子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這與文獻報道的RASSF10基因甲基化程度與轉(zhuǎn)移相關［10,12,15］這一結(jié)論相一致。本研究結(jié)果還顯示低分化組RASSF10基因甲基化率高于高、中分化組，Ⅲ、Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，這提示GCA的分化程度及分期可能同樣與RASSF10基因的甲基化相關。研究隨后分別應用RT-PCR及免疫組化的方法對RASSF10基因的mRNA及蛋白水平進行檢測，結(jié)果顯示GCA組織中該基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均顯著低于相應癌旁正常組織，這與Schagdarsurengin等［10］報道RASSF10基因在乳腺組織以外的幾乎所有正常組織中高表達相一致。且經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，RASSF10基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化的GCA組織其mRNA及蛋白表達水平顯著低于未發(fā)生甲基化組，提示RASSF10基因啟動子區(qū)的甲基化可能是導致該基因在GCA中失活的機制之一。此外Schagdarsurengin等［10］用去甲基化藥物5-aza-dC處理RASSF10基因表達缺失或降低的甲狀腺癌細胞系后，該基因的表達得以恢復或提高。Lu等［15］在多株食管癌細胞系中檢測到RASSF10基因mRNA表達水平的缺失或降低，并伴隨啟動子甲基化的發(fā)生，用去甲基化藥物5-aza-dC處理后，其表達得以恢復或提高。進一步證明了RASSF10基因CpG島的甲基化可導致該基因在腫瘤中的沉默。Wei等［16］也通過去甲基化藥物5-aza-dC處理RASSF10基因mRNA的表達缺失的胃癌細胞系使得該基因的表達得以恢復。同樣提示啟動子甲基化可能是導致RASSF10失活的主要機制。此外Wei等［16］還證明RASSF10過表達可顯著抑制胃癌細胞的生長和集落形成，并在裸鼠體內(nèi)抑制腫瘤的形成，siRNA介導的RASSF10缺失可顯著促進正常胃上皮細胞的生長，表明RASSF10具有腫瘤抑制功能。Hill等［11］在細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)過表達的RASSF10可導致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系克隆形成力下降，同樣表明RASSF10具有腫瘤抑制功能。

Knudson的二次打擊學說指出表觀遺傳沉默和雜合性缺失是導致RASSF10雙等位基因失活的兩個相關機制［17］。有研究報道，RASSF10過表達可降低β-連環(huán)蛋白的核積累，增加TCF/ LEF轉(zhuǎn)錄活性［16］。并通過檢測β-連環(huán)蛋白下游基因(c-Myc、cyclinD1、cyclinE1)和過氧化物酶體增殖物激活受體(CF-1、TCF-4、CD44)的表達水平以探究RASSF10誘導生長抑制的分子機制，發(fā)現(xiàn)這些分子的蛋白水平均顯著降低［18-21］。因此除DNA甲基化外，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導途徑的抑制可能也是RASSF10誘導細胞生長抑制、促進凋亡、降低細胞增殖的機制之一。

本研究證實GCA組織中RASSF10基因的甲基化率顯著高于癌旁正常組織，并伴隨轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的降低，且與腫瘤組織的分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。因此RASSF10有可能作為檢測GCA發(fā)生、發(fā)展及惡性程度的一個新的分子靶標，以期其在臨床治療過程中發(fā)揮一定指導作用，然而其具體分子生物學機制有待深入研究。

［1］ 董稚明, 郭煒, 何明, 等. 賁門腺癌中RASSFIA基因的甲基化狀態(tài)及表達［J］.腫瘤防治研究, 2009, 36 (7): 566-570.

［2］ HUANG Q, ZHANG L H. The histopathologic spectrum of carcinomas involving the gastroesophageal junction in the Chinese ［J］. Int J Surg Pathol, 2007, 15(1): 38-52.

［3］ VAN DER WEYDEN L, ADAMS D J. The Ras-association domain family (RASSF) members and their role in human tumourigenesis ［J］. Biochem Biophys Acta, 2007, 1776(1): 58-85.

［4］ SHERWOOD V, MANBODH R, SHEPPARD C, et al. RASSF7 is a member of a new family of RAS association domain-containing proteins and is required for completing mitosis ［J］. Mol Biol Cell, 2008, 19(4): 1772-1782.

［5］ YOKOYAMA Y, SAKAMOTO T, SATO S, et al. Evaluation of cytoreductive surgery with pelvic and paraaortic lymphadenectomy and intermittent cisplatin-based combination chemotherapy for improvement of long-term survival in ovarian cancer ［J］. Eur J Gynaecol Oncol, 1999, 20(5-6): 361-366

［6］ JONES P A, BAYLIN S B. The fundamental role of epigenetic events in cancer ［J］. Nat Rev Genet, 2002, 3(6): 415-428.

［7］ HESSON L B, COOPER W N, LATIF F. The role of RASSF1A methylation in cancer ［J］. Dis Markers, 2007, 23(1-2): 73-87.

［8］ 汪姍姍, 王寧, 于嘯, 等. 宮頸癌細胞系RASSFIA基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究 ［J］. 中國癌癥雜志, 2013, 23 (10): 777-783.

［9］ HESSON L B, DUNWELL T L, COOPER W N, et al. The novel RASSF6 and RASSF10 candidate tumour suppressor genes are frequently epigenetically inactivated in childhood leukaemias ［J］. Mol Cancer, 2009, 8: 42. doi: 10.1186/1476-4598-8-42.

［10］ SCHAGDARSURENGIN U, RICHTER A M, WOHLER C, et al. Frequent epigenetic inactivation of RASSF10 in thyroid cancer ［J］. Epigenetics, 2009, 4(8): 571-576.

［11］ HILL V K, UNDERHILL-DAY N, KREX D, et al. Epigenetic inactivation of the RASSF10 candidate tumor suppressor gene is a frequent and an early event in gliomagenesis ［J］. Oncogene, 2011, 30(8): 978-989.

［12］ HELMBOLD P, RICHTER A M, WALESCH S, et al. RASSF10 promoter hypermethylation is frequent in malignant melanoma of the skin but uncommon in nevus cell nevi ［J］. J Invest Dermatol, 2012, 132(3 Pt 1): 687-694.

［13］ D A N S R A N J A V I N T, W A G E N L E H N E R F, GATTENLOEHNER S, et al. Epigenetic down regulation of RASSF10 and its possible clinical implication in prostate carcinoma ［J］. Prostate, 2012, 72(14): 1550-1558.

［14］ LI Z, CHANG X, DAI D, et al. RASSF10 is an epigenetically silenced tumor suppressor in gastric cancer ［J］. Oncol Rep, 2014, 31(4): 1661-1668.

［15］ LU D, MA J, ZHAN Q, et al. Epigenetic silencing of RASSF10 promotes tumor growth in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Discov Med, 2014, 17(94): 169-178.

［16］ WEI Z, CHEN X, CHEN J, et al. RASSF10 is epigenetically silenced and functions as a tumor suppressor in gastric cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 432(4): 632-637.

［17］ JONES P A, LAIRD P W. Cancer epigenetics comes of age［J］. Nat Genet, 1999, 21(2): 163-167.

［18］ SANSOM O J, MENIEL V S, MUNCAN V, et al. Myc deletion rescues Apc deficiency in the small intestine ［J］. Nature, 2007, 446(7136): 676-679.

［19］ HE T C, CHAN T A, VOGELSTEIN B, et al. PPARdelta is an APC-regulated target of nonsteroidal anti-inflammatory drugs［J］. Cell, 1999, 99(3): 335-345.

［20］ KANWAR S S, YU Y, NAUTIYAL J, et al. The Wnt/ beta-catenin pathway regulates growth and maintenance of colonospheres ［J］. Mol Cancer, 2010, 9: 212. doi: 10.1186/1476-4598-9-212.

［21］ HE T C, SPARKS A B, RAGO C, et al. Identification of c-MYC as a target of the APC pathway ［J］. Science, 1998, 281(5382): 1509-1512.

Methylation status and expression of RASSF10 gene in gastric cardia adenocarcinoma

CUI Jianli, GUO Wei, GUO Yan-li, SHEN Su-peng, DONG Zhi-ming
(Cancer Institute, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

DONG Zhi-ming E-mail: dongzhiming2000@aliyun.com

Background and purpose: RASSF10 acts as a kind of tumor suppressor in various tumor tissues, but researches in cardiac adenocarcinoma has not been reported. This study aimed to detect the methylation status and expression of Ras-association domain family 10 (RASSF10) in gastric cardia adenocarcinoma (GCA), and explore its role in occurrence and development of GCA. Methods: Methylation speci fic polymerase chain reaction (MSP), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry method were respectively used to detect methylation status, mRNA expression and protein expression of RASSF10 in 81 GCA tissues and corresponding normal tissues.Results: The promoter methylation frequency of RASSF10 in GCA tissues (64.20%, 52/81) was signi ficantly higher than that in corresponding normal tissues (20.99%, 17/81, P＜0.05), and was closely correlated with TNM stages, differential degree and lymph node metastasis (P＜0.05). RASSF10 mRNA expression in GCA tissues (0.57±0.05) was significantly lower than that in corresponding normal tissues (0.78±0.02, P＜0.05), and was closely correlated with TNM stages and lymph node metastasis (P＜0.05). Protein expression of RASSF10 in GCA tissues (31.10%, 26/81) was signi ficantly lower than that in corresponding normal tissues (71.60%, 58/81, P＜0.05), and was closely correlated with TNM stages, differential degree and lymph node metastasis (P＜0.05). The promoter methylation frequency of RASSF10 in GCA tissues was inversely related to its protein expression.Conclusion: Inactivation of RASSF10 caused by aberrantmethylation in the promoter region may be closely correlated with the GCA tumorgenesis.

Gastric cardia adenocarcinoma; Methylation; RASSF10 gene

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.08.002

R734.2

A

1007-3639(2014)08-0568-07

2014-05-27

2014-07-11）

國家自然科學基金(No：81101854)；河北省醫(yī)學研究重大專項基金(No：冀財預復[2012]2056號)。

董稚明 E-mail:dongzhiming2000@aliyun.com