褪黑素與“脾應(yīng)長(zhǎng)夏”理論的關(guān)系及機(jī)理初探?

梁紅娟,常瑞華,季新燕,王穎莉,王 燕,孫偉衛(wèi),曹慧慧,馮前進(jìn),劉亞明,李俊蓮

(山西中醫(yī)學(xué)院,太原 030024)

光-褪黑素(melatonin，MT)生物信號(hào)傳導(dǎo)周期理論是一個(gè)很前沿的生物研究領(lǐng)域，MT的產(chǎn)生及晝夜分泌周期變化與外界日光照射存在著同步振蕩協(xié)調(diào)的關(guān)系，且MT分泌的季節(jié)性變化與自然界氣候變化同樣存在同步振蕩的關(guān)系[1]。一年中的冬季、早春、晚春、夏季、早秋、深秋測(cè)定山羊血清MT，早春和晚春、早秋和深秋的MT分泌水平也不一致[2]。這個(gè)理論為中醫(yī)“天人相應(yīng)”、“五臟應(yīng)時(shí)”理論現(xiàn)代研究提出了一種鏈接的契合點(diǎn)?！捌?yīng)長(zhǎng)夏”作為中醫(yī)“五臟應(yīng)時(shí)”理論的一個(gè)重要組成部分，認(rèn)為人體五臟中“脾”的相關(guān)生命活動(dòng)與長(zhǎng)夏季節(jié)產(chǎn)生同步的協(xié)調(diào)變化，此時(shí)五臟由脾當(dāng)令、由脾所主。如《靈樞·五音五味論》曰：“足太陰，臟脾，色黃，味甘，時(shí)季夏?！奔鞠臑橄募咀詈?個(gè)月即長(zhǎng)夏。課題組前期在MT與“心應(yīng)夏”關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，MT與心鈉素之間存在著一定的相關(guān)性[3]。本實(shí)驗(yàn)從MT隨季節(jié)變化的角度出發(fā)，探討內(nèi)源性MT與長(zhǎng)夏季節(jié)脾臟生理、病理模型的主要分子——胃泌素(gastrin，GAS)、胃動(dòng)素(motilin，MTL)之間的關(guān)系，將取材點(diǎn)設(shè)為長(zhǎng)夏正中之大暑當(dāng)日，以便于更好地反映長(zhǎng)夏季節(jié)的氣候變化特點(diǎn)，為“脾應(yīng)長(zhǎng)夏”理論的現(xiàn)代研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK(京)2009-0017)。

1.2 藥物與試劑

大黃飲片(購(gòu)自北京同仁堂藥店，由亳州市京皖中藥飲片廠生產(chǎn)，批號(hào)120201)，大鼠MT(批號(hào)E30014)、大鼠GAS(批號(hào)E30675)、大鼠MTL(批號(hào)E30375)的ELISA試劑盒(由美國(guó)R&D公司生產(chǎn))，酚紅(由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，批號(hào)20111204)、氫氧化鈉(由天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)，批號(hào)20110616)、羧甲基纖維素鈉(由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)，批號(hào)20110920)等。

大黃水煎液制備方法：將大黃飲片浸泡20 min水煎，待沸后15 min，煎液3層紗布過(guò)濾，二煎煎沸15 min，過(guò)濾法同上，合并2次煎液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮成1 g/L水煎液，分裝在小瓶中，4℃保存，室溫下灌胃用。

1.3 主要儀器

KDC-1044低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)，IKA-T25勻漿機(jī)(德國(guó))，SPECTRAMAX 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)，GZX-9076 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，721型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)。

2 方法

2.1 分組

將SD大鼠分成正常對(duì)照組、松果腺摘除手術(shù)組(手術(shù)組)、松果腺偽摘除手術(shù)組(假手術(shù)組)和脾氣虛組共4組。每組10只，雌雄各半，自由取食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(飼料為普通鼠全價(jià)顆粒飼料，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

2.2 造模

正常對(duì)照組大鼠自由取食和飲水，不施加任何處理因素；手術(shù)組大鼠于大暑前30 d行松果腺摘除術(shù)[3,4]；假手術(shù)組大鼠于大暑前30 d行偽手術(shù)[3,4]；脾氣虛組大鼠于大暑前21 d開(kāi)始脾氣虛模型復(fù)制[5]，造模以大黃法、游泳力竭法、饑餓法3種因素復(fù)合進(jìn)行，每日上午以20 g/(kg·d)劑量灌服1 kg/L大黃水煎液，每日下午將動(dòng)物負(fù)重(于大鼠尾根部纏繞質(zhì)量為該大鼠體質(zhì)量10%的鐵絲)放入水深40 cm、水溫20℃的水槽中游泳，以力竭為度(大鼠鼻尖沒(méi)入水面10 s)，同時(shí)每日早8∶00給食、晚8∶00撤食。

2.3 標(biāo)本采集

各組大鼠術(shù)前禁食12 h稱(chēng)重，每只大鼠用0.04%酚紅糊(含l0%羧甲基纖維素鈉)按照2 ml/只的量灌胃，20 min后乙醚麻醉后用毛細(xì)波管取眼眶血3 ml～5 ml，3000 r/min離心10 min，收集并分裝血清和血漿，-70℃冰箱存放待檢；后深麻醉處死動(dòng)物，迅速開(kāi)腹，結(jié)扎胃賁門(mén)和幽門(mén)，取胃置于15 ml的冷生理鹽水中，沿胃大彎剪開(kāi)，充分清洗胃內(nèi)容物，取洗液5 ml，3000 r/min離心10 min，吸取3 ml加入1 mol/LNaOH溶液0.5 ml中，吸上清液用分光光度計(jì)于560 nm波長(zhǎng)處比色，測(cè)其吸光度(A)，即為胃酚紅A值，測(cè)0.04%酚紅2 ml+生理鹽水15 ml+1 mol/LNaOH0.5 ml溶液的A，即為基數(shù)酚紅A值；取出小腸輕輕剝離后將其平鋪于白紙上，測(cè)量幽門(mén)至酚紅前沿的距離及幽門(mén)回盲部的小腸全長(zhǎng)。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 各組大鼠體質(zhì)量及脾氣虛組大鼠游泳時(shí)間的測(cè)定 正常組、手術(shù)組、假手術(shù)組每周檢測(cè)大鼠體質(zhì)量，脾氣虛組從造模第 1 天起，每日在灌胃前檢測(cè)大鼠體質(zhì)量，游泳時(shí)記錄游泳時(shí)間。并隨時(shí)觀察泄瀉、納呆、形瘦、行動(dòng)遲緩、被毛散亂豎起等情況變化，及時(shí)記錄在已制定的觀察表格中。

2.4.2 胃排空及小腸推進(jìn)速度測(cè)定[6]以胃酚紅殘留率(胃酚紅殘留率=A胃酚紅/A基數(shù)酚紅×100% )評(píng)價(jià)胃排空速度；以小腸推進(jìn)百分率(小腸推進(jìn)百分率=移行距離/小腸全長(zhǎng)×100%)評(píng)價(jià)小腸推進(jìn)速度。

2.4.3 血清MT、血清GAS 及血漿MTL的檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)其血清MT、血清GAS和血漿MTL的含量，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，樣本前后的變化采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，均數(shù)間的多組比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

正常對(duì)照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中精神良好，反應(yīng)敏捷，行動(dòng)有力，攝食正常，大便成形，被毛光澤緊密，體肌健壯。手術(shù)組與假手術(shù)組大鼠因手術(shù)原因，1周之內(nèi)精神安靜，反應(yīng)遲緩，被毛光澤豎起，飲食基本正常，大便成形。1周后傷口愈合，精神變好，反應(yīng)靈敏，行動(dòng)有力，攝食正常，大便成形，被毛光亮緊密，體肌健壯。脾氣虛組大鼠在造模前4 d其行為狀態(tài)、活躍程度、情緒反應(yīng)、皮膚毛發(fā)、飲食睡眠與大便狀態(tài)等均未出現(xiàn)明顯變化；第5天開(kāi)始多數(shù)大鼠開(kāi)始泄瀉，多為便溏、肛周污穢，逐漸出現(xiàn)厭食、閉眼、畏寒、反應(yīng)遲鈍、皮毛不澤甚至枯槁，并有毛發(fā)疏散、豎立、體質(zhì)量不增；第15天出現(xiàn)行動(dòng)變緩，成群蜷縮，飲食減少，皮毛不順，羸弱，游泳時(shí)間顯著變短。

3.2 大鼠體質(zhì)量變化及脾氣虛組大鼠游泳時(shí)間變化

表1顯示，與正常對(duì)照組比較，脾氣虛組大鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)，第30天的體質(zhì)量明顯低于造模前體質(zhì)量(P<0.01)，游泳時(shí)間也明顯短于造模前游泳時(shí)間(P<0.01)，而手術(shù)組與假手術(shù)組體質(zhì)量與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的變化及脾氣虛組大鼠游泳時(shí)間的變化(±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量的變化及脾氣虛組大鼠游泳時(shí)間的變化(±s)

組別例數(shù)第7天平均體質(zhì)量(g/只)第30天平均體質(zhì)量(g/只)第7天平均游泳時(shí)間(s/只)第30天平均游泳時(shí)間(s/只)正常對(duì)照組10229.50±24.39268.40±32.81 手術(shù)組10220.90±11.91270.10±40.36假手術(shù)組10220.20±11.96269.60±32.98脾氣虛組10223.50±20.78186.80±27.09**△△8.70±6.222.80±3.51△△

注：與正常對(duì)照組比較：**P<0.01；與脾氣虛組第7天比較：△△P<0.01

3.3 大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進(jìn)率、血清MT、血清GAS及血漿MTL的變化

表2顯示，與正常對(duì)照組比較，脾氣虛組大鼠胃酚紅殘留率高及小腸推進(jìn)率降低(P<0.05)，血清MT(P<0.01)、血清GAS(P<0.01)及血漿MTL(P<0.01)的含量明顯減小，說(shuō)明脾氣虛大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能減弱，大鼠脾氣虛能使血清MT、血清GAS及血漿MTL分泌減少；假手術(shù)組大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進(jìn)率、血清MT、血清GAS及血漿MTL均無(wú)明顯差異，說(shuō)明開(kāi)顱術(shù)對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)功能、血清MT、血清GAS及血漿MTL的產(chǎn)生均無(wú)明顯影響；手術(shù)組胃酚紅殘留率高及小腸推進(jìn)率降低(P<0.05)，血清MT(P<0.01)、血清GAS(P<0.01)及血漿MTL(P<0.05)的含量減小，說(shuō)明摘除大鼠松果腺后導(dǎo)致大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，大鼠血清中MT、GAS及血漿中MLT的含量明顯下降。與手術(shù)組比較，脾氣虛組大鼠血清GAS的含量明顯減小(P<0.05)，說(shuō)明大鼠經(jīng)造模后，胃腸道功能明顯下降，對(duì)GAS的分泌產(chǎn)生了顯著影響。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠胃酚紅殘留率高及小腸推進(jìn)率降低(P<0.05)，血清MT、血清GAS及血漿MTL的含量均減小(P<0.05)，說(shuō)明松果腺摘除后可致大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，大鼠血清中MT、GAS及血漿中MLT的含量下降。

表2 各組大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進(jìn)率、血清MT、血清GAS及血漿MTL的含量變化(±s)

表2 各組大鼠胃酚紅殘留率、小腸推進(jìn)率、血清MT、血清GAS及血漿MTL的含量變化(±s)

組別例數(shù)胃酚紅殘留率(%)小腸推進(jìn)百分率(%)MT(ng/L)GAS(ng/L)MTL(ng/L)正常對(duì)照組1051.20±21.6289.48±6.4342.09±3.50236.54±3.45267.61±5.61手術(shù)組1084.71±17.31*△83.39±5.52*△34.38±3.37**△235.69±2.19**△261.23±5.12*△假手術(shù)組1061.24±28.7789.77±6.9439.08±4.46236.68±2.93268.83±7.75脾氣虛組1080.65±16.20*81.47±6.21*33.60±2.93**232.77±3.26**#260.30±4.03**

注：與正常對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較：△P<0.05；與手術(shù)組比較：#P<0.05

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾主運(yùn)化，主升清，主四肢，為后天之本，氣血生化之源。脾氣虛弱，無(wú)力消化飲食水谷轉(zhuǎn)化成水谷精微，不能轉(zhuǎn)輸?shù)饺砀髋K腑，導(dǎo)致各臟腑器官失去濡養(yǎng)而出現(xiàn)全身消瘦、乏力、泄瀉等癥狀。本實(shí)驗(yàn)采用3種復(fù)合方法建立脾氣虛模型，運(yùn)用飲食不節(jié)、攻下、過(guò)度游泳的手段使大鼠處于后天失養(yǎng)、泄瀉、過(guò)度勞累的狀態(tài)，最終使脾氣受損。該方法與中醫(yī)學(xué)脾氣虛的病因基本一致。從實(shí)驗(yàn)中看到，脾氣虛組大鼠體質(zhì)量明顯下降，游泳時(shí)間顯著縮短，出現(xiàn)納差、泄瀉、蜷縮、毛發(fā)無(wú)澤等一系列癥狀，其胃排空速度延緩，小腸推進(jìn)速度減慢，MTL和GAS分泌量下降，說(shuō)明脾氣虛模型建立成功。與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[7,8]。

MT是由腦內(nèi)松果腺分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有晝夜、季節(jié)性變化規(guī)律[9]。有學(xué)者經(jīng)多年研究[10]認(rèn)為，松果腺是五臟調(diào)控與五季關(guān)系的中介；松果腺隨著季節(jié)變化而分泌不同含量的MT，可能是中醫(yī)學(xué)五臟與五時(shí)相通應(yīng)的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)，是五臟調(diào)控機(jī)制的控制器。松果腺和其分泌的MT對(duì)雄性大鼠的腸道動(dòng)力系統(tǒng)可產(chǎn)生一定的影響，具體作用機(jī)制尚待研究[11]。外源性MT可因劑量不同對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)起到雙向調(diào)節(jié)的作用[12]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，MT含量與胃腸運(yùn)動(dòng)功能、MTL、GAS的含量存在一定的聯(lián)系，這種聯(lián)系表現(xiàn)為正相關(guān)，正常大鼠與脾氣虛大鼠在長(zhǎng)夏季節(jié)大暑當(dāng)天分泌的MT與松果腺腺體分泌的MT具有一致性，可以推測(cè)脾氣虛組血清GAS和血漿MTL的減少和胃腸運(yùn)動(dòng)功能的降低與大鼠血清MT的減少有關(guān)。摘除松果腺的手術(shù)組血清MT的減少可能引起GAS、MTL分泌減少和胃腸運(yùn)動(dòng)功能降低，即長(zhǎng)夏季節(jié)，MT可能參與調(diào)控脾臟的生理功能，保護(hù)胃腸道的正常運(yùn)動(dòng)和GAS、MLT 2種胃腸道激素的正常分泌，抑或脾在長(zhǎng)夏的功能正常與否關(guān)系著GAS、MTL的分泌及胃腸正常運(yùn)動(dòng)的發(fā)揮。GAS、MTL可能參與MT對(duì)胃腸道系統(tǒng)的調(diào)控過(guò)程，是光-MT信號(hào)調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)活動(dòng)的有關(guān)分子之一。

GAS、MTL均是腦腸肽，不僅分布在胃腸道中，也分布在中樞神經(jīng)中。GAS可刺激胃酸、胃蛋白酶、促胰液素、胰酶等分泌，增強(qiáng)胃腸道的運(yùn)動(dòng)和胃黏膜的生長(zhǎng)。MTL對(duì)消化間期的復(fù)合運(yùn)動(dòng)與胃腸道的運(yùn)動(dòng)、分泌都有強(qiáng)烈的作用。研究發(fā)現(xiàn)，中樞MTL對(duì)胃腸的作用是通過(guò)一種非腎上腺素非膽堿能神經(jīng)元完成的，而迷走神經(jīng)是其信號(hào)下傳的通路[13]。由此推測(cè)，MT下降可能引起中樞神經(jīng)沖動(dòng)抑制，阻斷胃腸激素信號(hào)在下丘腦-延髓-迷走神經(jīng)的傳導(dǎo)，非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)元最終不能在胃腸道形成沖動(dòng)，GAS、MLT的含量下降，從而導(dǎo)致胃腸平滑肌松弛、張力及蠕動(dòng)減弱，胃排空時(shí)間延長(zhǎng)，小腸運(yùn)動(dòng)減弱，胃腸運(yùn)動(dòng)異常，消化功能低下。

綜上所述，MT與“脾應(yīng)長(zhǎng)夏”理論存在著一定相關(guān)性，MT與GAS、MTL之間存在正相關(guān)，正常大鼠與脾氣虛大鼠在長(zhǎng)夏季節(jié)大暑當(dāng)天分泌的MT與松果腺腺體分泌MT具有一致性，說(shuō)明MT分泌的季節(jié)性變化與自然界氣候的變化存在一個(gè)同步振蕩的關(guān)系[1]。這也是中醫(yī)“天人相應(yīng)”、“五臟應(yīng)時(shí)”理論的物質(zhì)基礎(chǔ)。外周神經(jīng)中的GAS、MTL含量與中樞神經(jīng)中同一物質(zhì)的作用機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)途徑需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，松果腺分泌的MT以及血清GAS、血漿MTL可作為“五臟應(yīng)時(shí)”理論研究中的信號(hào)分子。

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