中藥超微粉腧穴敷貼對變應性鼻炎大鼠TGF-β1和IL-17含量影響的研究?

陳 靜，陳俊琦，黃 泳，張嘉玲，唐純志

(1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院針灸推拿教研室，廣州 510515; 2.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科，廣州 515630;3.廣州中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，廣州 510405)

變應性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)又稱過敏性鼻炎，是變應原激發(fā)由IgE介導的I型變態(tài)反應性疾病。一般認為，是Th1/Th2免疫反應失衡或免疫細胞向Th2細胞過度分化及鼻黏膜的高反應性引起的。但新的研究顯示，CD4+T淋巴細胞應該分為Th1、Th2、Treg和Th17四大亞群[1,2]。

Treg細胞屬于調(diào)節(jié)性T細胞(Thr)亞型之一，具有免疫抑制調(diào)節(jié)功能，主要分泌TGF-β1細胞因子。Th17主要介導炎癥反應，研究表明IL-17與變應性炎性反應有重要的相關性[3～5]，其分泌的主要效應因子為白細胞介素17(Interleukin 17，IL-17)。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和Th17細胞的發(fā)現(xiàn)以及相互間的關系，在更高層面為解釋變應性鼻炎的發(fā)生提供了依據(jù)[6]。

腧穴敷貼法是在傳統(tǒng)針灸醫(yī)學基礎上應用中藥作用于腧穴，通過經(jīng)絡對機體的調(diào)整作用而達到預防和治療疾病的一種中醫(yī)外治法[7]。臨床上被廣泛應用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如慢性支氣管炎、哮喘、變應性鼻炎等，并收到良好的臨床療效。本實驗旨在觀察中藥超微粉腧穴敷貼對AR大鼠血清TGF-β1和IL-17含量的影響，以探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

2月齡50只SD大鼠，雌雄各半(購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號0074460)，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，分籠置于室溫18～22℃，12 h間斷照明，自由進食水。按隨機數(shù)字表法將實驗動物分成正常對照組10只(雄5雌5)和造模組40只(雄20雌20)2組。動物適應性喂養(yǎng)3 d后進行造模，將造模成功的AD模型大鼠再隨機分為即空白模型組(A組)、丙酸氟替卡松組(B組)、普通粉組(C組)和超微粉組(D組)4組，每組10只。

1.2 實驗試劑

卵清蛋白(OVA，Sigma Chemical Co. P.O)；氫氧化鋁Al(OH)3粉佐劑(天津市市福晨化學試劑廠)；Rat TGF-β1 ELISA Kit、Rat IL-17 ELISA Kit (武漢博士德生物工程公司)；丙酸氟替卡松(輔舒良)鼻噴霧劑(英國葛蘭素史克有限公司)。

1.3 中藥腧穴敷貼劑

普通粉(組成：白芥子粉、延胡索粉、細辛粉、甘遂粉)，批號080710，購于廣州致信中藥飲片有限公司；超微粉成分同普通粉，由廣東省第二中醫(yī)院藥劑科粉碎成粒徑范圍0.1～75 μm，粒度分布中心D50≈10～15 μm，達300目以上的超微粉。所有中藥均經(jīng)過南方醫(yī)科大學中藥制劑教研室鑒定，藥粉敷貼前均混合新鮮姜汁并調(diào)和均勻。

1.4 取穴

大鼠大椎、肺俞、腎俞定位參考《常用實驗動物穴位定位》。大椎位于第7頸椎與第1胸椎間、背部正中，肺俞位于第3胸椎下兩旁肋間，腎俞位于第2腰椎下兩旁。

1.5 實驗方法

1.5.1 模型制備 卵清蛋白(OVA)10 mg + Al(OH)3粉末30 mg + 生理鹽水1ml制成混懸液，對造模組大鼠行腹腔內(nèi)注射，隔日1次共7次，作為基礎致敏。第15天進行加強免疫，給予5%OVA 50u1滴鼻/(側(cè)/d)和1%OVA噴霧吸入5 min，連續(xù)7 d。正常對照組大鼠給予等量生理鹽水代替進行腹腔注射、滴鼻及噴霧吸入刺激(方法同上)。

1.5.2 行為學計分 分別與治療前后進行激發(fā)后30 min觀察并記錄大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為。計數(shù)噴嚏個數(shù)：1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分；鼻涕留至鼻孔處為1分，過鼻孔為2分，流涕滿面為3分；鼻癢輕擦鼻1～2次為1分，抓撓鼻、面不止，到處擦摩為2分。以上各項指標均采用疊加量化記分法，總分5分表示造模成功。經(jīng)評定，造模組所有大鼠評分均超過5分，顯示本組大鼠全部造模成功。

1.5.3 治療方法 丙酸氟替卡松組(B組)：給予丙酸氟替卡松氣霧劑噴鼻，每日1次，每次50 μg，連用10 d。普通粉組(C組)首先進行備皮，用眼科剪沿穴位周圍剪毛，縱向范圍是大椎至腎俞，橫向范圍是脊柱兩側(cè)各旁開1.5 cm。將按比例配置好的普通粉與新鮮姜汁調(diào)和均勻，制成0.5 cm×0.5 cm大小的藥塊，用3 cm×3 cm一次性紙膠布固定于穴位，再使用一次性透氣孔膠布纏繞一圈以加固藥貼。每次貼藥4 h，連續(xù)10 d。超微粉組(D組)采用超微粉敷貼，方法同普通粉組?？瞻啄Ｐ徒M(A組)給予生理鹽水滴鼻，每日1次，連用10 d。正常對照組不采取任何處理措施。

1.5.4 外周血TGF-β1、IL-17水平檢測 摘眼球法取大鼠外周血，將血液靜置2 h，離心取上清液。根據(jù)酶標儀檢測結(jié)果得到樣品的吸光值，利用標準曲線的方程式計算得出待檢樣品中TGF-β1、IL-17的濃度(ng/ml)，稀釋標準為1∶99。根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，按照標準曲線計算標本所測濃度。

1.5.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，血清TGF-β1、IL-17采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血清TGF-β1的表達

表1顯示，TGF-β1多重分析結(jié)果顯示，A組血清TGF-β1含量較正常對照組大幅升高，提示造模成功；D組血清TGF-β1含量較A組、B組、C組顯著下降(P<0.05)，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.05)；B組血清TGF-β1含量較A組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組血清TGF-β1含量較A組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而B與C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.993)。綜合分析結(jié)果提示，超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉均顯著降低AR大鼠因過敏導致的血清TGF-β1異常升高，其中超微粉效果最好，而普通粉與丙酸氟替卡松效果相當。

2.2 各組大鼠外周血清IL-17的表達

表2顯示，IL-17多重分析結(jié)果顯示， A組大鼠血清IL-17含量較正常對照組大幅升高，提示造模成功；D組大鼠血清IL-17含量較A組、B組及C組顯著下降(P<0.05)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.903)；B組大鼠血清IL-17含量較A組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組大鼠血清IL-17含量較A組下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組大鼠血清IL-17含量較C組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.01)。綜合分析結(jié)果提示，超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉均降低了AR大鼠因過敏導致的血清IL-17異常升高，其中超微粉效果最好，普通粉次之，丙酸氟替卡松稍差。

表1 AR大鼠外周血各組TGF-β1的表達(±s)

表1 AR大鼠外周血各組TGF-β1的表達(±s)

組 別正常對照組空白模型組(A組)超微粉組(D組)普通粉組(C組)丙酸氟替卡松組(B組)FPTGF-β1(ng/ml)10.08±3.66#21.30±4.14*#△★13.53±4.36*17.75±3.77*★17.77±3.07*△12.875<0.001

注：正常對照組與A組比較：#P<0.01；B組與A組比較：△P<0.05；D組與A組、B組、C組比較：*P<0.05；C組與A組比較：★P<0.05；C組與B組比較：☆P<0.05

表2 各組大鼠外周血清IL-17的表達(±s)

表2 各組大鼠外周血清IL-17的表達(±s)

組 別正常對照組空白模型組(A組)超微粉組(D組)普通粉組(C組)丙酸氟替卡松組(B組)FPIL-17(ng/ml)577.20±43.28#753.42±66.66*#△★574.26±48.53*627.98±56.96*★☆692.30±50.23*△☆20.676<0.001

注：正常對照組與A組比較：#P<0.01；B組與A組比較：△P<0.05；D組與A、B、C組比較：*P<0.05；C組與A組比較：★P<0.05；C組與B組比較：☆P<0.05

3 討論

變應性鼻炎是常見的呼吸道變應性疾病，具有反復發(fā)作、遷延難愈的特點，全球平均發(fā)病率為10%～25%左右[8,9]。目前西醫(yī)治療以激素治療、免疫脫敏療法為主，但由于其實際療效不確切、副作用明顯等原因，僅有56%～58%的AR患者認為其治療有效[9]，因此較多患者選擇中醫(yī)藥療法進行治療。腧穴敷貼療法是臨床上廣泛應用的中醫(yī)藥療法之一，是集腧穴、藥物兩者作用于一體的獨特治療方法。臨床證實，腧穴敷貼療法對變應性疾病尤其是變應性鼻炎有獨特療效[10,11]。本實驗采用《張氏醫(yī)通》中記載的敷貼藥方，將其制成有效組分溶出率和生物利用率均更高的中藥超微粉，選取大椎、肺俞、腎俞進行腧穴敷貼治療。

AR的發(fā)生涉及一系列炎癥細胞(嗜酸粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞等)和眾多的細胞因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子以及炎癥遞質(zhì)，此外還存在神經(jīng)調(diào)節(jié)、遺傳學因素等作用[12]，機制尚未完全明確。雖然目前普遍認為變應性鼻炎與Th1和Th2失衡有關，但一些現(xiàn)象還不能完全用它來說明[13]。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和Th17細胞的發(fā)現(xiàn)為解釋AR的發(fā)生以及炎癥程度起到了更好的補充。Treg細胞和Th17兩者在分化過程中具有相關性，正常情況下，TGF-β誘導初始CD4+T細胞分化為Treg；當伴有感染或炎癥時，IL-6和TGF-β共同啟動初始CD4+T細胞向Th17分化，從而誘導以Th17為主的炎癥應答[14]。雖然在分化上密切相關，但是在功能方面的研究表明，Thl7細胞的促炎癥反應機制對介導免疫耐受的Treg 細胞有明顯的拮抗作用[15,16]，當機體處于正常狀態(tài)下兩者保持平衡，但機體發(fā)生功能異常時常表現(xiàn)出Treg/Th17失衡，引起一系列炎癥反應損傷機體。在研究與AR有類似發(fā)病機制的疾病(如哮喘、自身免疫性疾病、鼻息肉)時發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg細胞比率的失衡都在它們的發(fā)病機制中起重要作用[17,18]。因此也有研究推斷，Th17/Treg細胞的失衡與AR的發(fā)病機制密切相關[19]。

本實驗結(jié)果顯示，AR大鼠血清中TGF-β1和IL-17模型組較正常對照組均大幅升高，說明TGF-β1的表達增高促進了IL-17數(shù)量的增加，證實Veldhoen等[14]的實驗結(jié)果，TGF-β在誘導初始T細胞分化為Thl7細胞中起著重要作用。TGF-β1 3組藥物干預組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，我們認為通過藥物治療使造模后升高的TGF-β1水平降低，這樣促使TGF-β1免疫抑制能力的恢復，從而抑制淋巴細胞的增殖以及Th17細胞的分化。伴隨著IL-17水平的降低，進一步控制AR的炎癥程度。IL-17 3組藥物干預組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，以超微粉效果最好，說明3組藥物均能有效降低IL-17的水平，從而降低炎癥反應程度，進一步從動物實驗驗證臨床上變應性鼻炎的病情輕重與Th17細胞轉(zhuǎn)錄因子及IL-17水平的高低呈正相關。

通過綜合分析認為，本實驗中TGF-β1參與Th17細胞的分化，這與大多數(shù)研究結(jié)果一致。此外，目前普遍認為TGF-β與Th17細胞在功能上互相拮抗。本實驗中AR大鼠的TGF-β1與IL-17均升高，顯示TGF-β1對IL-17起正向調(diào)控的作用，同時IL-17又反作用于TGF-β1，在功能上起拮抗作用，與Annunziato F、Evans HG等結(jié)果一致[20，21]。但由于不同物種、不同疾病之間有不同的變化，因此TGF-β1也起到不同的調(diào)節(jié)作用。臨床及實驗研究證實了這一點。查閱有關AR患者及動物實驗的文獻發(fā)現(xiàn)，外周血TGF- β1的結(jié)果很不一致，分別有增高、降低和無變化的結(jié)果報道。但無法否認的是，TGF-β1確實參與了Th17細胞的分化，其含量的升高與IL-17的升高成正相關，說明TGF-β1與Th17促炎癥反應發(fā)生的程度有密切關系，兩者在維持AR免疫穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著重要的作用。

參考文獻：

[1] Romagnani S. Regulation of the T cell response [J]. Clin Exp Allergy,2006,36: 1357-1366.

[2] Castellino F, Germain R N. Cooperation between CD4+and CD8+T cells: when, where, and how [J]. Annu Rev Immunol, 2006, 24 (1):519-540.

[3] Miyamoto M, Prausc O, Sjostrand M, et al. Endogenous IL-17 as a mediator of neutrophil recruitment caused by endotoxin exposure in mouse airways[J]. J Immunol, 2003, 170(9):4665-4672.

[4] Zou GM, Tam YK. Cytokines in the generation and maturation of dendritic cells : recent advances[J].European Cytokine Net, 2002, 13(2):186-199.

[5] Ciprandi G, De Amici M, Murdaca G, et al. Serum interleukin-17 levels are related to clinical severity in allergic rhinitis[J]. Allergy, 2009, 64(9):1375-1378.

[6] 楊春平,羅英,劉月輝.Th17/Treg細胞與變應性鼻炎的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2011,40(26):2685-2687.

[7] 陸壽康.刺法灸法學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:156.

[8] St rachan D, Sibbald B,W eiland S, et al. Wo rldw ide variations in prevalence of symptoms of allergic rhinoconjunctivit is in children [J]. Pediatr Allergy Immunol,1997,8:161.

[9] 劉爭,高起學,崔永華. 美國變應性鼻炎最新調(diào)查報告[J]. 中國醫(yī)學文摘耳鼻咽喉科學,2007,22(5):289-291.

[10] 陸亞康,劉敏.穴位貼敷法治療過敏性鼻炎50例臨床觀察[J]. 中國中醫(yī)藥科技,2010,17(3):262-263.

[11] 陳嬋芳,顧軍養(yǎng).中藥穴位敷貼治療過敏性鼻炎的療效觀察[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(23):2898-2899.

[12] 史敏,皇甫輝,張春明等. Th-17細胞在小鼠變應性鼻炎模型中的表達及調(diào)控作用報告[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2011,25(14):652-655.

[13] 盧漢桂,彭華,陳德華,等.轉(zhuǎn)錄因子RORC2和白細胞介素17的表達與變應性鼻炎癥狀關系的研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2011,46(2):144-147.

[14] Veldhoen M, H ocking RJ, Flavel l RA, et al. Signals medated by transforming growth fact or beta initiate autoimmune encephalom yelit is , but chronic inflammat- ion is needed to sustain disease[J]. Nat Immunol, 2006, 7( 11) : l151-1156.

[15] Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, et al. Phenotypic and functional features of human Thl7 cells[J]. J Exp Med, 2007, 204(8): 1849-1861．

[16] Evans HG, Suddason T, Jackson I, et al. Optimal induction of T helper 17 cells in humans requires T cell receptor ligation in the context of Toll-like receptor activated monocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(43): 17034-17039．

[17] 張藍方.Th17/Treg平衡調(diào)節(jié)與疾病的關系研究進展[J].濟寧醫(yī)學院學報,2011,34(1):68-70.

[18] 沈暘,洪蘇玲,胡國華,等.鼻息肉患者外周血Th17/Treg細胞比率的失衡及其臨床意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2011,27(12):1139-1141.

[19] 張成,洪蘇玲,胡國華.變應性鼻炎患者Treg/Th17細胞相關轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子的失衡表達[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2012,26(5):209-211.

[20] Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, et al. Phenotypic and functional features of human Thl7 cells[J]. J Exp Med, 2007, 204(8): 1849-1861．

[21] Evans HG, Suddason T, Jackson I, et al. Optimal induction of T helper 17 cells in humans requires T cell receptor ligation in the context of Toll-like receptor activated monocytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(43): 17034-17039．