HPLC測定喉癥丸中蟾酥的含量

周月玲

摘要：目的：建立喉癥丸中蟾酥的主要成分華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量測定方法，通過測定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量對其質(zhì)量進(jìn)行控制；方法：采用高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography,HPL-C)，選用色譜柱為Hypersil-C18柱（250mm×4.6mm，5?m），流動相為乙腈-水（50:50）；柱溫為20℃，流速為0.5ml?min-1；測定波長為296nm；進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：華蟾酥毒基進(jìn)樣量在0.101~1.2625μg(r=0、999993)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均回收率(n=6)為99.07%,RSD為0.37%。酯蟾毒配基進(jìn)樣量在0.10118~1.26475μg(r=0.999996)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均回收率(n=6)為99.137%,RSD為0.38%。結(jié)論：該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，利用高效液相色譜法測定喉癥丸中蟾酥的含量，可以為喉癥丸的定量分析建立標(biāo)準(zhǔn)。可用于喉癥丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：喉癥丸；蟾酥；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基；HPLC

【中圖分類號】R 927 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1672-8602(2014)05-0294-02

1 前言

本文建立了喉癥丸中蟾酥含量測定的高效液相色譜法，該法具有分離效果好、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本法簡便、快捷,準(zhǔn)確度高,專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

2 儀器與試藥

Agilent1200LC全自動高效液相色譜儀，G1311A四元泵，G1311A自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，AgilentG1313A可變波長紫外檢測器，Agilent1200化學(xué)工作站；AL204型電子天平；MX5型百萬分之一電子天平；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

乙睛為色譜純；甲醇為分析純；水為去離子水。

對照品：華蟾酥毒基對照品，脂蟾毒配基對照品。由中國藥品生物制品檢定所提供。

喉癥丸樣品由廣州白云山敬修堂股份有限公司提供。

3 方法與實(shí)驗(yàn)

3.1 色譜適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)：

色譜柱為HypersilODSC18柱（250mm×4.0mm，5μm，依利特），乙腈-水（50:50）為流動相，流速為0.5ml?min-1，檢測波長296nm，進(jìn)樣量為10μl柱溫為20℃。理論塔板數(shù)應(yīng)不低于4000。

3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24h的華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品各50mg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度制成每1ml含華蟾酥毒基50μg、脂蟾毒配基50μg的溶液，即得。

3.1.2 供試品溶液的制備：

取本品適量，研細(xì)，取0.6175g，精密稱定，置25ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲提取1h，取出，放冷至室溫，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

3.1.3 陰性對照溶液的制備：

取除去蟾酥的其他處方藥材，按樣品制備方法制成陰性樣品，按"3.1.2"項(xiàng)下方法制成陰性液。

分別取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液各10μL,按照上述色譜條件進(jìn)樣測定,結(jié)果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時(shí)間處有一致的色譜峰,華蟾酥毒基和脂蟾毒配基色譜峰與其他組分達(dá)到基線分離，陰性溶液在與對照品溶液相同的保留時(shí)間處無吸收峰，陰性樣品不干擾樣品測定。

A

B

C

A喉癥丸供試品液相色譜圖，B華蟾酥毒基與脂蟾毒配基對照液相色譜圖，C缺蟾酥陰性對照液相色譜圖

圖2.1 缺蟾酥陰性樣品、華蟾酥毒基與脂蟾毒配基對照品及喉癥丸HPLC色譜圖

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性范圍考察：

分別精密吸取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品的混合溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25μl，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，得華蟾酥毒基回歸方程為：Y=37.319476X-0.528097，r=0.999993；脂蟾毒配基回歸方程為：Y=37.213288X-3.842857，r=0.999996。結(jié)果表明華蟾酥毒基在0.101~1.2625μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；脂蟾毒配基在0.10118~1.26475μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1，圖1。

表1 華蟾酥毒基的線性范圍

進(jìn)樣量（μl） 2 5 10 15 20 25

Y 75.10196 185.07298 372.14923 559.16516 747.03766 931.90411

回歸方程 Y=37.319476X-0.528097，r=0.999993

圖1 華蟾酥毒基與脂蟾毒配基校正曲線

3.2.2 精密度試驗(yàn)：

精密吸取同一供試品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測得峰面積,計(jì)算華蟾酥毒基、酯蟾毒配基RSD分別為0.68%和0.62%。結(jié)果顯示華蟾酥毒基和脂蟾毒配基精密度良好。

〖HJ1.4mm〗

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：

取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、24h進(jìn)樣10μl，測定華蟾酥毒基峰面積。24h內(nèi)基本無變化。測得華蟾酥毒基峰面積的平均值為462.77363，RSD為0.68%，脂蟾毒配基峰面積的平均值為206.937276，RSD為0.57%，其結(jié)果顯示喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)：

取同一批號（批號：H10033）喉癥丸按供試品溶液制備方法制備5份供試樣品，分按含量測定項(xiàng)下方法測定，測得華蟾酥毒基峰面積的平均值為464.1008，RSD為0.68%，脂蟾毒配基峰面積的平均值為209.0346，RSD為0.57%。

3.2.5 回收率試驗(yàn)：

取批號為H10034的喉癥丸，粉碎為粉末約0.6175g，精密稱定，共6份，置帶塞的錐形瓶中，各精密加入濃度為0.125mg/mL的華蟾酥毒基和0.055mg/mL的脂蟾毒配基混合對照液10mL，按3.2.2供試液制備的方法制成加樣供試品溶液。測得樣品中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。分別計(jì)算回收率。

結(jié)果顯示華蟾酥毒基回收率為99.07%，RSD=0.37%<3%；脂蟾毒配基回收率為99.17%，RSD=0.38%<3%。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明所建立的方法加樣回收率較高，符合含量測定要求。

4 結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用Agilent1200LC全自動高效液相色譜儀，HypersilODSC18柱（250mm×4.0mm，5μm，依利特）為色譜柱，乙腈-水（50:50）為流動相，流速為0.5ml?min-1，檢測波長為296nm，進(jìn)樣量為10μl，柱溫為20℃，高效液相法測定喉癥丸中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。結(jié)果華蟾酥毒基進(jìn)樣量在0.101~1.2625μg(r=0.999993)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均回收率(n=6)為99.07%,RSD為0.37%。酯蟾毒配基進(jìn)樣量在0.10118~1.26475μg(r=0.999996)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均回收率(n=6)為99.17%,RSD為0.38%。而且該方法簡便快速重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，精密度強(qiáng)。從理論上來說，HPLC法測得的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，減少了薄層掃描法提取過程中產(chǎn)生的誤差，縮短了提取時(shí)間，而且HPLC法具有較高的分離效率和較快的分析速度，分離出制劑中的蟾酥的含量，較好地控制了制劑的質(zhì)量；從企業(yè)的經(jīng)濟(jì)考慮，運(yùn)用高效液相色譜法，提高了生產(chǎn)效率，方法簡便快速，縮短了提取時(shí)間，減少了試劑的用量，從而又降低了成本。故此方法可以作為喉癥丸中蟾酥含量測定的方法。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)中曾嘗試幾種不同型號的色譜柱,其結(jié)果供試品分離效果均不理想,干擾較大,兩組分保留時(shí)間相差較短,主峰拖尾較嚴(yán)重等問題。結(jié)果以本實(shí)驗(yàn)中采用的HypersilODSC18柱分離效果為佳,雜質(zhì)峰不干擾華蟾酥毒基和醋蟾毒配基的峰形,且二者能達(dá)到完全分離,保留時(shí)間適中,取得了較滿意的分離效果。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，配制一定濃度的華蟾酥毒基對照品溶液、脂蟾毒配基對照品溶液及二者的混合對照品溶液,在200~400nm波長處進(jìn)行掃描,結(jié)果表明：華蟾酥毒基對照品在294nm處有最大吸收,脂蟾毒配基對照品在298nm處有最大吸收,二者混合對照品在296nm處有最大吸收,故確定檢測波長為296nm。與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。又根據(jù)中國藥典2010年版一部蟾酥含量測定項(xiàng)下規(guī)定蟾酥測定波長為296nm,況且在本實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用296nm作為檢測波長。試驗(yàn)結(jié)果,表明在296nm處,輔料基本沒有干擾,故選用296nm波長來測定,結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確。

曾采用中國藥典測定蟾酥中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量的流動相0.5﹪磷酸二氫鉀-乙腈（50:50）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2），結(jié)果華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的分離度不佳，且操作繁瑣。通過查閱文獻(xiàn)[16-20],發(fā)現(xiàn)曾有人采用甲醇-水-冰醋酸系統(tǒng)、乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)和不同比例的乙腈-水系統(tǒng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，預(yù)實(shí)驗(yàn)用乙腈-水（55:45）為流動相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分離度也未達(dá)到要求。后來通過參照文獻(xiàn)[21]和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水（50:50）時(shí)，華蟾酥毒基與脂蟾毒配基峰形對稱，分離完全，雜質(zhì)干擾少，基線平直，故采用乙腈-水（50:50）作為流動相。另外，使用乙腈作為流動相還有諸多好處：（1）乙腈HPLC吸收最?。ㄌ貏e是在短波長上小）；（2）UV檢測中的梯度基線上乙腈HPLC級產(chǎn)生鬼峰少；（3）乙腈和甲醇分別用同樣的比率與水混合時(shí),一般情況下,乙腈的洗脫能力強(qiáng)。

本試驗(yàn)分別用甲醇回流及甲醇超聲方法進(jìn)行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取之后的供試品溶液與超聲提取的供試品溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒有明顯差別。而且采用甲醇超聲提取法，簡便，易行，提取效率并未下降且溶液易于濾過，故用該提取方法。

本實(shí)驗(yàn)分別對超聲提取的時(shí)間進(jìn)行了考察，對供試品溶液分別超聲處理20,30,60min按實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下方法制備所需溶液,并按色譜條件進(jìn)行測定,結(jié)果表明，用甲醇超聲30min，提取效率較高并已提取完全，因此確定超聲提取時(shí)間為30min。

通過在不同的柱溫條件下進(jìn)行試驗(yàn),開始用25℃進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基的色譜峰已經(jīng)分離完全，分離度高。但是脂蟾毒配基與旁邊的干擾峰分不開。經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn)柱溫20℃時(shí)分離度好,分離時(shí)間適中,可保證在正常時(shí)間內(nèi)完成檢測任務(wù)。

結(jié)束語

由于中藥成分比較復(fù)雜，使用高效液相色譜分析法作為其質(zhì)量控制的主要方法，這種測量方法分離效果好，分析速度快，靈敏度高，準(zhǔn)確，操作自動化，簡單方便,是對中藥進(jìn)行成分分析的一種極有價(jià)值的分析技術(shù)。實(shí)驗(yàn)中也可以體驗(yàn)到方法的優(yōu)勢。以前曾用TLC－UV法測定蟾酥的含量操作繁瑣，準(zhǔn)確性差，所以采用高效液相色譜法，可以為喉癥丸的質(zhì)量控制提供了快速、準(zhǔn)確的測定方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010版）一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:265.

[2] 高學(xué)敏.全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007:512-513.

[3] YehJY，HuangWJ，KanSF，eta1．Effectofbufalinandcinobufaginontheproliferationofandrogendependentandindependentp

rostatecancercells[J]．Prostate，2003，54(2)：112-124．