利用微衛(wèi)星標記高效鑒定松浦鏡鯉的親緣關系

胡雪松，葛彥龍，李池陶，王世會，賈智英，張秋軍，石連玉

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

利用微衛(wèi)星標記高效鑒定松浦鏡鯉的親緣關系

胡雪松，葛彥龍，李池陶，王世會，賈智英，張秋軍，石連玉

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

用37尾雌和14尾雄松浦鏡鯉Cyprinus carpio Songpu構建37個血統(tǒng)明確的全同胞家系，同池、同條件養(yǎng)殖。用篩選出的9個多態(tài)性微衛(wèi)星標記和建立的多重PCR檢測方法進行子代群體（1 318尾）的親權鑒定。9個位點共檢測到53個等位基因，各位點均為高度多態(tài)（PIC＞0.5），平均期望雜合度為0.742，觀測雜合度為0.755。親本基因型信息的模擬分析顯示，利用9個標記將子代分配到親本對的成功率可達100%。實際鑒定結(jié)果：1 287尾個體準確鑒定到配組的親本對，鑒定成功率為97.6%。以上結(jié)果表明：本研究提供的標記和檢測方法可用于松浦鏡鯉的親本遺傳距離分析和家系親緣追溯，也適用于群體遺傳多樣性監(jiān)測。

松浦鏡鯉；微衛(wèi)星；家系；親緣關系

微衛(wèi)星標記在基因組中廣泛分布，具有豐富的多態(tài)性且按孟德爾方式共顯性遺傳，比傳統(tǒng)的同工酶或其他標記更能反映近緣個體間的遺傳差異[1-3]，已成為水產(chǎn)動物遺傳學相關研究中應用最廣泛的分子標記[4-6]，其應用范圍包括群體遺傳結(jié)構分析[7-9]、基因圖譜構建[10-14]及親緣關系鑒定等[15-17]。

魚類特殊的生活環(huán)境和繁殖方式容易發(fā)生系譜混亂，導致優(yōu)良生產(chǎn)性狀或適應性逐代下降。鑒定親本的親緣關系可提供配組依據(jù)，降低近交幾率。和畜禽等養(yǎng)殖動物相比，魚類出生時個體較小，難以利用物理標記進行早期個體區(qū)分。在家系選育或遺傳參數(shù)評估時，為剔除環(huán)境因素的非遺傳性效應，很多研究將不同家系來源的受精卵混合孵化，或?qū)⒊醴踝恤~在相同條件下混合養(yǎng)殖，再利用微衛(wèi)星標記鑒定家系來源[18-20]。鑒定親緣關系的前提是需要有足夠多的多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標記位點。為使外形和目標性狀趨于穩(wěn)定，魚類新品種培育須經(jīng)多世代的高強度選擇，等位基因可能會較大程度地丟失。在此情況下，屬間甚至種間的微衛(wèi)星引物會失去通用性，因此篩選特定品種的分子標記十分必要。

松浦鏡鯉是黑龍江水產(chǎn)研究所于2008年在德國鏡鯉選育系（F4）的基礎上培育出的鯉新品種，是水產(chǎn)原良種委員會的登記品種（GS01-001-2008）。該品種鱗少易加工，其生長速度和出肉率遠高于其他鯉品種，且目前已被推廣到全國20多個省市養(yǎng)殖，帶來了巨大的經(jīng)濟和社會效益。然而，目前尚未開發(fā)出適合松浦鏡鯉親緣關系鑒定的分子標記。本研究通過構建已知親本對的松浦鏡鯉家系，從中篩選出9個高度多態(tài)微衛(wèi)星位點，建立各位點基因型的快速檢測方法用于親緣關系鑒定，旨在為指導該品種親魚的科學配組或輔助制定家系選育計劃提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 家系構建

實驗用松浦鏡鯉（SJ）來自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗中心。于2013年，挑選健康雄性親魚14尾和雌性37尾，以不平衡的巢氏交配的方法配組，每尾雄魚與2、3尾雌魚交配，利用人工授精建立37個全同胞家系。配組時收集親魚鰭條樣本，將帶有不同組合編號的受精卵單獨孵化。孵化后的子代個體始終同池、同條件養(yǎng)殖，生長至60d時，采集所有子代個體（1 318尾）的鰭條用于親緣關系鑒定。

1.2 DNA提取

采用酚氯仿法提取所有親本和子代樣本鰭條基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度。DNA原液稀釋至200ng/μL，置 -20℃保存，DNA工作液稀釋至50ng/μL，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選和PCR擴增

實驗選用部分在德國鏡鯉選育系F4（JL）中擴增效果較高的MFW系列引物（MFW1、MFW5、MFW7、MFW11），參考Crooijmans等[21]報道的序列合成。另外9對引物均來自本實驗室開發(fā)的HLJ系列，篩選自鯉新一代連鎖圖譜[10]，相關信息見表1。PCR擴增體系共20μL，包括ddH2O 13.7μL、10× PCR buffer 2μL、1.5mM MgCl21.6μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上下游引物各0.6μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.08μL，及50ng/μLDNA模板1μL。PCR反應條件為：94℃變性4min；94℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃延伸5min，4℃保溫。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。利用銀染法顯帶并拍照，用Gel-pro analyzer軟件確定等位基因大小。進一步進行4個多重PCR反應，分別包含以下引 物 組 合 ：1（HLJ1115、HLJ3656、HLJ3526）、2（HLJ3473、HLJ3850）、3（HLJ3857、HLJ3993）、4（HLJ3 938、HLJ3948），PCR反應體系均為20μL，體系僅ddH2O作相應改變，其余各成分體積均與單引物PCR反應相同。反應退火溫度分別為55℃、57℃、55℃和58℃，其他反應條件及PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳檢測和顯帶方法與單引物PCR反應相同。將基因型數(shù)據(jù)整理成0、1矩陣。

表1 松浦鏡鯉家系鑒定的微衛(wèi)星標記引物信息Tab.1 Microsatellite primers information on family identification of Songpu mirror carp

1.4 遺傳參數(shù)統(tǒng)計和家系分配計算

利用實驗室自編軟件將包含親本和子代的0、1矩陣基因型文件轉(zhuǎn)換成Genepop格式文件。利用Cervus3.0軟件統(tǒng)計等位基因數(shù)，計算多態(tài)信息含量、期望雜合度和觀測雜合度等遺傳參數(shù)。基于親本的基因頻率，運行模擬分析模塊（已知親本性別父母對）分析，置信概率為95%，子代樣本數(shù)為1 500，候選父本為14，母本為37。同時基于各家系（子代）群體的基因頻率，計算累積排除率，綜合判斷各位點的鑒定能力。最后利用家系分析模塊（已知親本性別父母對）計算出候選父母的LOD值，LOD值越大代表可信度越高，如將子代個體分配到組建的家系視為鑒定成功。

1.5 遺傳距離分析

利用PopGen32軟件計算家系（子代）間各組合及各家系親本組合間的Nei氏遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物擴增效果檢測

選擇在JL擴增效果理想的MFW系列引物擴增SJ DNA樣本進行擴增，效果不理想。不同微衛(wèi)星位點在JL中表現(xiàn)為高度多態(tài)[22]，但在本次SJ中檢測到的等位基因數(shù)和基因型均較少（表2），未在后續(xù)研究中應用。

表2 MFW系列引物在JL和SJ中擴增的等位基因數(shù)比較Tab.2 Comparison of allele number（Na）amplified in JL and SJ by primers from the MFW series

已篩選出的9對HLJ系列引物擴增SJ DNA樣本，各位點擴增和分型效果均較理想，適合SJ家系鑒定。各位點的聚丙烯酰胺檢測結(jié)果見圖1。不同位點組合后，其多重PCR產(chǎn)物的聚丙烯酰胺檢測結(jié)果見圖2。

圖1 松浦鏡鯉在9個微衛(wèi)星位點的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.1 The polyacrylamide gel electrophoresis results at 9 microsatellite loci in Songpu mirror carp

圖2 松浦鏡鯉在9個位點的多重PRC擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.2 The polyacrylamide gel electrophoresis results of multiple PCR at 9 microsatellite loci in Songpu mirror carp

2.2 遺傳變異參數(shù)和家系鑒定

9個微衛(wèi)星位點共檢測到53個等位基因，平均每個位點為5.89個。平均期望雜合度和觀測雜合度分別為0.742和0.755，所有位點均為高度多態(tài)（PIC＞0.5）（表3）。模擬分析顯示，利用9個位點將任意已知基因型的子代樣本鑒定到父本的概率為82%，而鑒定到母本的概率僅為40%，鑒定到父母對的概率為100%（圖3）。利用各位點的基因頻率計算累積排除率，隨位點數(shù)目的增加，累積排除率增大（圖4）。在父母基因型未知的情況下，9個位點的累積排除概率為0.99046；在已知一個親本基因型時，累積排除另一個親本的概率為0.99948；累積排除親本對的概率為0.99997。對同一家系的隨機個體而言，累積排除概率為0.99754。在1 318尾個體中，有31尾鑒定到多個親本對，其余1 287尾個體準確鑒定到36個家系，鑒定率為97.6%。

表3 9個微衛(wèi)星標記在松浦鏡鯉家系中的遺傳參數(shù)分析Tab.3 Genetic parameters analysis of families in Songpu mirror carp by 9 microsatellite markers

圖3 利用9個微衛(wèi)星位點預測松浦鏡鯉母本、父本和親本對的成功率Fig.3 Predicted assignment success rate of Songpu mirror carp for mother alone,father alone and parent pair using nine microsatellite loci

圖4 基于基因頻率計算微衛(wèi)星位點數(shù)與累積排除概率之間的關系Fig.4 Relationship between number of microsatellite loci and combined exclusion probability based on gene frequency

2.3 遺傳距離

遺傳距離計算結(jié)果顯示，各家系親本間的遺傳距離范圍為0.285～0.762（圖5），而各家系（子代）間組合的遺傳距離范圍很小，平均僅為0.029，最大為0.133（圖6）。

圖5 各家系親本間的遺傳距離Fig.5 Genetic distances between parents of each family

圖6 各家系（子代）間遺傳距離Fig.6 Genetic distances between each family（offspring）

3 討論

經(jīng)過多代強化選育后，松浦鏡鯉表型（體型、鱗被）特征的遺傳一致性較選育前更高。多個在德國鏡鯉選育系（F4）或其他鯉品種中具有豐富多態(tài)性的微衛(wèi)星座位在松浦鏡鯉中已純合或多態(tài)性較低，不宜于在家系鑒定中應用。這充分表明該品種選擇強度較高，其基因庫整體遺傳多樣性下降。本研究獲得9個具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，平均等位基因數(shù)為4～7個，遠低于在3個德國鏡鯉選育系（F4）群體中檢測到的結(jié)果（14.4個）。相比較而言，雖然檢測位點的平均雜合度較高，但不代表群體有相應的多樣性水平。

在利用分子標記鑒定親緣關系前，需先進行模擬分析，初步確定標記的檢測效率和合理的標記數(shù)目。當鑒定的家系較多或親本基因型信息不清時，應有足夠多的標記才能準確區(qū)分親本來源。模擬分析顯示，利用7個高度多態(tài)標記（PIC＞0.7）將斑節(jié)對蝦Penaeus monodon的子代準確匹配到30個家系的成功率低于80%；當設定為13個家系時，能正確匹配的比率達到96%[23]。該結(jié)果與本研究相似，當松浦鏡鯉設定為36個家系時，利用7個標記成功鑒定父母對的比率為76%，而當標記數(shù)增加到9個時，成功率達到100%。進一步利用基因頻率計算累積排除率，在親本性別已知時，9個標記的累積排除概率可達到0.99997。以上結(jié)果是利用9個標記進行親本來源鑒定的依據(jù)。實際鑒定結(jié)果與模擬分析相符，97.6%子代個體成功分配到配組家系，其中2.4%的個體分配到多個家系，這可能是基因型誤判所致。

本研究在家系建立前未進行親本親緣關系的測算，利用篩選出的標記計算出的各家系親本間的遺傳距離為0.285～0.762。根據(jù)孫效文等[24]在德國鏡鯉選育系（F4）中的研究結(jié)果，親本遺傳距離的可選范圍是0.2～0.7，因此松浦鏡鯉親本間存在較大的配組選擇空間。另一方面，36個子代家系間的遺傳距離范圍很小，僅為0.029～0.133，這可能與松浦鏡鯉較高的選育強度有關。

綜合本研究結(jié)果可知，經(jīng)過多代的強化培育，松浦鏡鯉不僅表型（形態(tài)、鱗被等）具有很強的一致性，群體的基因型一致性水平也有較大提高。本研究篩選出的9個多態(tài)性分子標記和檢測方法可用于監(jiān)測不同地區(qū)或來源的松浦鏡鯉群體遺傳多樣性的動態(tài)變化。在該品種未來的選育實踐中，可用這些標記和檢測方法建立核心群的系譜檔案追溯混養(yǎng)子代的親本來源。

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Highly Effective Identification of Genetic Relationship of Songpu Mirror Carp（Cyprinus carpio Songpu）Using Microsatellite Markers

HU Xue-song,GE Yan-long,LI Chi-tao,WANG Shi-hui,JIA Zhi-ying,ZHANG Qiu-jun,SHI Lian-yu
（National and Local United Engineering Laboratory for Freshwater fish Breeding,Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In the present study,37 females and 14 males of Songpu mirror carp（Cyprinus carpio Songpu）were used to establish 37 full-sib families with clear genealogy,and all offspring individuals were cultured in a same pond and under the same conditions.Nine polymorphic microsatellite markers were chosen,and a multiple PCR detection method was furtherly used for the parentage assignment of 1 318 offspring samples.A total of 53 alleles were detected and each locus showed high polymorphism（PIC＞0.5）.The average expected and observed heteroygosity were 0.742 and 0.755,respectively.The simulation analysis based on genotypic information of parents showed that 100%of progeny could be correctly assigned the parent pair using 9 markers.In fact,the assignments to the actual family of 1 287 individuals with 9 loci were completed,and the success rate was 97.6%.All these results suggest that our marker suite can be used for genetic diversity detection,genetic distance analysis and parentage assignment in Songpu mirror carp.

Songpu mirror carp;microsatellite;family;genetic relationship

S917

A

1005-3832（2016）05-0037-06

2016-05-26

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費資助項目（HSY201302）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-46-02）；國家科技支撐計劃資助項目（2012BAD26B02；2012BAD26B01）.

胡雪松（1977-），男，博士，從事魚類生理和育種研究.E-mail:huxuesong@hrfri.ac.cn

石連玉（1960-），男，研究員，從事魚類遺傳育種研究.E-mail:sly2552@yahoo.com.cn