低溫定向冷凍法凍存食蟹猴精液的研究

唐丹等

摘要

[目的]使用低溫定向冷凍方法建立有效的精子凍存條件。[方法] 采用低溫定向冷凍方法凍存食蟹猴精液，并與常規(guī)方法進行對比，探討冷凍方法和甘油濃度對精子冷凍存活率的影響。[結(jié)果] 在相同甘油濃度下，低溫定向冷凍的食蟹猴精子

的活力與頂體完整性顯著高于常規(guī)冷凍法（P<0.05），定向冷凍方法在保存食蟹猴精液效果明顯優(yōu)于常規(guī)冷凍方法， 且甘油濃度5%時能夠達到更好的冷凍效果。[結(jié)論]與常規(guī)冷凍相比，低溫定向冷凍能顯著提高精子存活率。在食蟹猴的精液凍存中，采用定向冷凍儀凍存精液能達到較好的凍存效果。

關(guān)鍵詞食蟹猴； 精液冷凍； 甘油； 常規(guī)冷凍；低溫定向冷凍

中圖分類號S865.3+1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）06-01699-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish the effective preservation method of frozen sperm by directional freezing technique. [Method] The sperm of M. fascicularis was frozen by directional freezing technique and it was compared with conventional freezing technique. The effects of freezing method and glycerol concentration on the freezing survival rate of sperm were discussed. [Result] At the same concentration of glycerol， The sperms motility and acrosome integrity of M. fascicularis by directional freezing technique were higher than that by conventional freezing technique. The preservation effects of sperm of M. fascicularis by directional freezing technique were obviously better than that by conventional freezing technique. And the best freezing effects were obtained with 5% glycerol. [Conclusion]Compared with conventional freezing technique， directional freezing technique could enhance the survival rate of sperm. Better freezing effects were obtained when the sperm of M. fascicularis was frozen by using directional freezing instrument.

Key words Macaca fascicularis； Sperm cryopreservation； Glycerol； Conventional freezing； Directional freezing

由于生物學特性與人類極其相似等原因食蟹猴已成為生物醫(yī)學中使用廣泛的一種實驗動物，同時它也屬于《瀕危野生動植物物種國際貿(mào)易公約》（2003 年修訂版）的二級保護動物，屬于瀕危物種[1]。因此，對食蟹猴的生殖繁殖顯得尤為重要，食蟹猴人工授精作為人工輔助生殖技術(shù)已經(jīng)普遍運用于食蟹猴生殖過程中，人工受精的前提條件是建立優(yōu)良的精子庫，因此高效的精子冷凍方法對于食蟹猴的生殖繁殖、優(yōu)良資源遺傳基因的保存具有重要意義。

目前，對于食蟹猴精液保存的研究已有大量報道[2-9]，而體外受精成功率卻一直不高，這可能是由于冷凍過程中精子受損嚴重，凍存復(fù)蘇后精子存活率明顯下降。靈長類動物精子冷凍使用最廣泛的是常規(guī)冷凍方法，即凍存麥管懸放于液氮上空，通過液氮蒸氣實現(xiàn)降溫冷凍，此方法簡單快捷，較易實現(xiàn)，因此也在精液保存中被普遍使用，但正是因為其裝置簡單，許多因素不能控制，受人為因素的影響太多。

近年來，一種新的冷凍方法——低溫定向冷凍法被運用于精液冷凍上，已經(jīng)成功用于許多動物精液的冷凍保存[10-17]，人們將歐洲野兔定向冷凍后的精子與新鮮精子同時用于人工授精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組兔子在受孕率等方面并無顯著差異[13]。定向冷凍后的精子用于人工受精成功孕育了世界上第一只小犀牛[12]。定向冷凍的特點是基于多重溫度梯度的原理，裝有精液的冷凍管以精確可控的速率進入設(shè)定不同溫度的2個低溫冷凍倉中，使精子降溫速率精確可控，在這個定向降溫過程中有效減少了胞內(nèi)冰晶的形成，減少對精子的損傷。與定向冷凍相比，常規(guī)冷凍由于降溫速率不能人工控制，對冰晶形成也不可控，對精子的傷害更大。筆者用低溫定向冷凍方法凍存食蟹猴精液，并與常規(guī)方法進行對比，探討其對食蟹猴精子的凍存效果，以冷凍復(fù)蘇精子的活力、凍后復(fù)蘇率和頂體完整率作為精子凍存復(fù)蘇后功能狀態(tài)的檢測指標。

1 材料與方法

1.1實驗動物

試驗所用精液來自3只成年健康雄性食蟹猴（7歲），均由昆明亞靈生物科技有限公司提供且達到實驗動物管理要求標準，每只食蟹猴單籠飼養(yǎng)，保持每日12 h光照與黑暗，22 ℃恒溫。試驗項目提前獲得了昆明亞靈生物科技有限公司動物使用和管理委員會的批準。

1.2精液采集

肌肉注射鹽酸氯胺酮（5 mg/kg體重）麻醉食蟹猴，通過陰莖電刺激法采集精液[18]。收集精液于37 ℃水浴中液化30 min 后，取10 μl用于檢測精子活力和頂體完整性，剩余部分用預(yù)熱的TALP-Hepes+0.3%BSA進行適當稀釋[19]，200 g離心10 min洗去精漿，重復(fù)2次后去掉上清液，輕柔混勻沉淀部分用于精子冷凍。

1.3防凍液的配制

精子冷凍稀釋液（Sperm-diluting medium）的成分參照TTE[8]。將稱取的物質(zhì)溶解于Milli-Q水中并定容，將溶液置于室溫下以7 000×g的速率離心1 h，以去除卵黃顆粒，然后收集上清液，用NaOH 或HCl調(diào)節(jié)pH至7.2，將上清液分裝并儲存于-80 ℃冰箱中待用。試驗前于37 ℃水浴中解凍，按比例加入不同濃度的甘油，制成食蟹猴精子防凍液（TTE-G）。

1.4精子冷凍保存與解凍復(fù)蘇

洗過的精液用預(yù)熱至37 ℃的不含甘油的TTE稀釋10倍，平均分成2份放入10 ml試管中并封口。將試管浸入500 ml裝有室溫水的燒杯中，并置于4 ℃的冰箱中緩慢降溫2 h。向2個試管中分別加入等體積的、預(yù)冷至4 ℃、含有4%與10%甘油的精子冷凍液TTE-G，因此甘油的終濃度為2%與5%（本過程中TTE-G的加入共分5次加完，每次加入1/5 體積，間隔6 min）。2%和5%的甘油濃度的精液分別又分成2份，一份進行常規(guī)冷凍，一份進行定向冷凍。

1.4.1

常規(guī)冷凍。將稀釋好的精液分裝入預(yù)冷至4 ℃的冷凍麥管（0.25 ml）中，封口機封口。向1個大小為35.7 cm×35.7 cm×39.7 cm的塑料泡沫盒內(nèi)注入液氮，平衡20 min，并保持液氮深度為10 cm。將麥管水平放置在1個10 cm×10 cm大小的鋁架上，將鋁架懸掛于塑料泡沫盒內(nèi)，于液氮面上方5 cm處冷凍10 min后投入液氮保存。解凍時將冷凍麥管于37 ℃ 水浴中2 min，檢測精子活力和頂體完整性。

1.4.2

定向冷凍。稀釋好的精液1 ml裝入冷凍玻璃管（2 ml）中，放入定向冷凍儀中，玻璃管以1.5 mm/s的速度從A艙向左到達B艙，其中A艙為4 ℃，B艙為-50 ℃，最后玻璃管進入-70 ℃的收集艙中，最后放入液氮中保存[17]。

解凍時將冷凍管從液氮中迅速取出，停留在空氣中90 s，直接投入37 ℃水浴中2 min，迅速攪動使精子解凍復(fù)蘇，然后測定活力和頂體完整性[17]。

1.5精子功能的檢測

1.5.1

精子運動度的檢測。

精子運動度（即精子活力）是呈直線運動的精子占全部精子總數(shù)的百分率。將新鮮精液與解凍復(fù)蘇后的精液稀釋至適當濃度后，取10 μl置于預(yù)熱至37 ℃的載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡下計數(shù)直線前進運動精子與非直線運動精子的比例，計算出活力，每次至少計數(shù)200個精子，每份樣品計數(shù)3次。最后精子活力為3次計數(shù)所得活力的平均值。

精子運動度復(fù)蘇率是精子冷凍復(fù)蘇運動度與新鮮精子運動度的比值，用以體現(xiàn)精子凍后運動度恢復(fù)力的重要參數(shù)之一。

1.5.2

頂體的完整性。按照以下公式計算頂體完整性：

頂體完整率（﹪）=頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù)×100﹪。

新鮮或冷凍精液（調(diào)節(jié)精子懸液的濃度為40×106～60×106個/ml）涂片空氣干燥，然后用無水乙醇固定30 min，涂片再次空氣干燥。將100 μl 40 μg/ml FITC標記的花生凝集素（FITC-PNA）覆蓋涂片，37 ℃避光孵育30 min后PBS沖洗。使用熒光顯微鏡觀察頂體的熒光著色狀態(tài)，頂體完整的精子被染成均勻的蘋果綠色，而頂體不完整的精子部分著色或不著色。分別記錄頂體完整精子占精子總數(shù)的百分率。每份樣品制作2 個涂片，每個涂片觀察200個以上的精子（分左、右2個區(qū)），取2片的平均值。

1.6試驗設(shè)計

共用精液10份，來自3只食蟹猴，每份精液平均分成2份，一份用于常規(guī)冷凍，另一份用于定向冷凍，用于常規(guī)冷凍的精液一部分用含2%甘油濃度的防凍液凍存，另一部分用含5%甘油濃度的防凍液凍存，且保證2份精液的冷凍同時進行，定向冷凍也同常規(guī)冷凍一樣采用2種甘油濃度的冷凍液凍存（2%，5%），也同時進行冷凍。冷凍后的精液解凍后檢測活力與頂體完整性，作為檢測精子功能狀態(tài)的指標。3 討論

甘油是靈長類動物精子冷凍保存中使用最廣泛的冷凍劑[20]，屬于滲透性保護劑，在冷凍過程中滲入精子內(nèi)部，濃縮細胞內(nèi)水分，減少胞內(nèi)冰晶的形成，達到保護精子的作用，甘油在滲入細胞的同時也會改變質(zhì)膜的性質(zhì)，導致膜的穩(wěn)定性和通透性發(fā)生改變，如果這種改變幅度過大，大于冰晶形成的傷害，便會損傷精子，因此甘油濃度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)，若甘油濃度過高或過低都會對精子造成損傷。近年來已有許多關(guān)于食蟹猴甘油濃度的研究，普遍認為常規(guī)方法冷凍食蟹猴精液甘油的最適濃度范圍為3%～5%，若小于3%或大于5%，冷凍效果都會下降[5-6，8-9]。在該試驗中常規(guī)冷凍下當甘油濃度降到2%，凍后活力與頂體完整性都下降，當?shù)陀谧钸m甘油濃度5%時，降低甘油濃度會導致精子存活率的降低，而作為一種更有效地冷凍方法——低溫定向冷凍方法，它相對于常規(guī)冷凍能更有效地減少冰晶的形成，對精子的傷害更小。結(jié)果表明，當甘油濃度為2%時，凍后活力與頂體完整性顯著高于常規(guī)冷凍2%（P<0.05），還高于常規(guī)冷凍5%（P>0.05），定向冷凍在較低甘油濃度下，取得比常規(guī)冷凍更好的冷凍效果。這表明定向冷凍能降低甘油濃度，當將常規(guī)冷凍的最適甘油濃度用于定向冷凍中時，凍后精子存活率不僅高于常規(guī)冷凍5%時（P<0.05），也顯著高于常規(guī)冷凍2%組（P>0.05）。這表明常規(guī)冷凍的最適甘油濃度5%同樣適于定向冷凍，定向冷凍不僅在降低甘油濃度時達到更好的冷凍效果，當甘油濃度增加到5%時達到最好的冷凍效果。從精子凍后復(fù)蘇率來看，定向冷凍5%時精子復(fù)蘇率最高，高于甘油濃度為2%時（P>0.05）。綜上所述，無論甘油濃度高（5%）還是低（2%），定向冷凍都優(yōu)于常規(guī)冷凍，當甘油濃度為5%時，凍存效果達到最佳。

定向冷凍優(yōu)于常規(guī)冷凍，這不僅是因為定向冷凍嚴格控制降溫速率，使精子緩慢適應(yīng)低溫環(huán)境，減少冰晶形成，定向冷凍還有許多優(yōu)于常規(guī)冷凍的方面，由于定向冷凍一開始就是為了精子的冷凍而設(shè)計發(fā)明的，其最小冷凍量為2 ml，與常規(guī)冷凍相比它能實現(xiàn)精液的大劑量凍存，這相對于常規(guī)冷凍的麥管（250 μl/管）既能節(jié)省時間，又能避免精液裝管的時候溫度波動對于精子的影響，許多操作技術(shù)（如精子的性別鑒定等）都需要大量精子作為研究對象，定向冷凍滿足了這一點。常規(guī)冷凍過程中由于麥管數(shù)量較多，在保存過程中容易造成不同凍存麥管的混淆與丟失，并且也增加了凍存的空間。而定向冷凍避免了這些問題。大劑量凍存的精液相對于麥管凍存能夠抵御操作者在選取目標樣本過程中造成的溫度變化，其在室溫下能保持在-100 ℃ 2 min，這使操作者有足夠時間挑選所需要的樣本精液，這是常規(guī)冷凍所無法做到的。

目前，運用定向冷凍方法對非人靈長類精子進行保存的并不多，僅見獼猴[21]，在獼猴研究中定向冷凍與常規(guī)冷凍對精子的活力和頂體完整性差異不大，這可能是由于不同物種以及不同個體精子的耐受度不同。筆者首次嘗試用定向冷凍方法凍存食蟹猴的精液，運用此方法不僅能有效促進食蟹猴優(yōu)良遺傳資源的保存，也能充分發(fā)揮優(yōu)良食蟹猴的繁殖效率。

綜上所述，與常規(guī)冷凍相比，低溫定向冷凍能夠顯著提高精子存活率，因此在食蟹猴的精液凍存中，有條件的情況下盡量采用定向冷凍儀凍存精液，能夠達到良好的凍存效果。

42卷6期唐 丹等低溫定向冷凍法凍存食蟹猴精液的研究

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