中藥提取物的組方及其對致病性大腸桿菌的抑菌試驗

賀泂杰　賀奮義　郭慧琳

摘 要：通過試驗，篩選出毒性低，具有止瀉、退熱作用的中草藥黃連、黃芩、白頭翁、秦皮、鐵莧菜、四季青、苦參和穿心蓮等。根據(jù)其有效成分的性質(zhì)，對各藥有效成分進行提取。將提取物按照一定的比例組成不同的配方，采用瓊脂平板稀釋法，對仔豬致病性大腸桿菌標準毒株K99和本試驗室分離鑒定的O1、O2、O8、O138、O141、O78、K89進行體外抑菌試驗，結果表明，配方四所含各提取物的含量最小，抑菌效果最佳。

關鍵詞：中藥提取物；組方；致病性大腸桿菌；體外抑菌

中圖分類號：S853 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2014）06-0050-02

大腸桿菌（Escherichia coli，Elcoli）又稱為大腸埃希菌，屬革蘭氏陰性桿菌，由Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的。大腸桿菌主要寄居在人體的大腸內(nèi)，常引起嚴重腹瀉，甚至敗血癥。當它侵入人體其他一些部位時，可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎等。目前臨床抑殺大腸桿菌仍以抗生素為主。但近年來大腸桿菌對多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，特別是產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌，其耐藥率逐年有升高的趨勢。許多中草藥天然具有對大腸桿菌的抑制殺滅作用，其抗菌作用日益受到重視。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥材

黃連、黃芩、白頭翁、秦皮、四季青、鐵莧菜、苦參和穿心蓮，均購自蘭州市醫(yī)藥超市。將購買的中草藥用蒸餾水洗凈風干，然后用電動粉碎機將其粉碎后備用。

1.1.2 試驗菌種

大腸桿菌標準毒株（K99），購于中國獸藥監(jiān)察所。仔豬致病性大腸桿菌（O1、O2、O8、O138、O141、O78、K89）由平?jīng)鲐i場采集病料分離鑒定。

1.1.3 供試菌種培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，一般選用LB瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4 主要儀器

生化培養(yǎng)箱，不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，手動可調(diào)試移液器，電子天平，粉碎機，單人雙面凈化工作臺，電熱恒溫水浴鍋，電熱恒溫干燥箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥有效成分的提取

采用不同的提取方法對中藥有效成分進行提取。

1.2.2 菌株復蘇及純化

用接種環(huán)分別蘸取8種不同的細菌，分別加入到裝有一定量LB液體培養(yǎng)基的帶塞試管中，做好標記，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)18 h。將配好的LB固體培養(yǎng)基放入微波爐中加熱融化，倒入培養(yǎng)皿中，厚度為5 mm左右，靜置讓其固化；用接種環(huán)分別蘸取8種不同的細菌，于培養(yǎng)皿中劃線以得到單個菌落，37 ℃于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h；用接種環(huán)挑取單個菌落移入裝有LB液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，置于溫箱中37 ℃震蕩培養(yǎng)以得到一定濃度的較純菌液。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，一般選用LB瓊脂培養(yǎng)基。營養(yǎng)瓊脂按說明，溶化高壓滅菌，冷卻45 ℃左右倒板，厚度為4 mm，備用。

1.2.4 菌液制備

用接種環(huán)分別蘸取純化的細菌，于培養(yǎng)皿中劃線培養(yǎng)以得到單個菌落；用接種環(huán)挑取單個菌落接種于2 mL LB培養(yǎng)液內(nèi)，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)6 h，1∶1 000倍稀釋備用。

1.2.5 中藥提取物的組方及其對致病性大腸桿菌的體外抑菌試驗

將硫酸黃連素、黃芩苷、白頭翁、秦皮、四季青、鐵莧菜、苦參和穿心蓮提取物按照不同的配伍和用量組成不同的配方進行試驗研究。最后篩選出四個效果比較好的配方進行試驗（表1）。

以上配方按照一定工藝加水至10 mL，調(diào)pH值7.5～8，制成10倍濃縮液，10磅高壓滅菌20 min，分別吸取經(jīng)滅菌的四種配方藥液1 mL、0.8 mL、 0.6 mL、0.5 mL、0.4 mL、0.3 mL、0.2 mL、0.1 mL到滅菌的平皿中，加入LB瓊脂培養(yǎng)基至10 mL，混勻，冷卻凝固后成梯度濃度含藥瓊脂平板，畫好分區(qū)，按照瓊脂平板稀釋法進行四個配方對八種致病性大腸桿菌的體外抑菌試驗。

2 結果

2.1 中草藥有效成分的提取

針對各藥不同的化學有效成分，分別設計了對黃連、黃芩、白頭翁、秦皮、四季青、鐵莧菜和苦參中活性成分的提取工藝，提取獲得硫酸黃連素純品、 黃芩苷純品、30∶1白頭翁提取物、30∶1秦皮提取物、50∶1四季青、30∶1鐵莧菜提取物、20∶1苦參提取物和20∶1穿心蓮提取物。

2.2 中藥提取物的組方及其對致病性大腸桿菌的抑菌試驗

將硫酸黃連素純品、黃芩苷純品、30∶1白頭翁提取物、30∶1秦皮提取物、 50∶1四季青、30∶1鐵莧菜提取物、20∶1苦參提取物和20∶1穿心蓮提取物按照一定的比例進行配伍，并按照瓊脂平板稀釋法進行體外抑菌試驗，結果見表2。

由表2可見，配方二和配方四抑菌效果比較好，而以配方四所含各提取物的含量最小。

3 分析與討論。

3.1 將8味中藥提取物組方進行體外抑菌活性試驗

四個配方均有明顯的體外抑菌作用。綜合分析，配方四所含各提取物的含量最小，抑菌效果最佳。

3.2 中草藥提取物的體外抑菌試驗

所得結論對臨床用藥只是起到一個理論指導作用。依據(jù)中獸醫(yī)學理論可知，一般單味藥的作用要比多味藥差，因為許多中草藥之間都具有協(xié)同相加的作用。藥物配伍適當，能有效提高療效，減少藥品用量，降低成本，為中草藥的復方制劑研制及實踐應用提供可能。

3.3 甘肅省是我國中草藥的主產(chǎn)區(qū)之一有豐富的資源優(yōu)勢

因此，應用中獸醫(yī)理論，結合現(xiàn)代先進的生產(chǎn)設備，探索科學的工藝流程，合理開發(fā)應用這一資源，不僅在獸醫(yī)臨床上具有較好的治療價值，而且對養(yǎng)殖、種植戶脫貧致富奔小康具有現(xiàn)實意義?！酢?/p>

參考文獻：（6篇，略）