操作簡單且低成本的木聚糖酶檢測方法

邵建忠 潘雪男 夏俊花

在所有單胃動物飼料中，約85 %的飼料被認(rèn)為至少添加了一種商用酶制劑，飼料配方的成功越來越依賴于這些酶制劑所帶來的動物生產(chǎn)性能上的益處。木聚糖酶分析方法上的突破能夠確認(rèn)酶在飼料中的存在及其水平。

中圖分類號：S816.17 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1001-0769（2014）06-0012-02

對飼料生產(chǎn)商而言，能夠證明飼料成品含有能確保其含有的酶達(dá)到正確的含量和活性的標(biāo)準(zhǔn)是飼料質(zhì)量控制和保證方案的一個重要組成部分。例如，如果日糧在添加木聚糖酶后，其能量水平可以降低，飼料中酶的含量和活性能達(dá)到如預(yù)計的水平是非常重要的。由于在實現(xiàn)這一目標(biāo)的過程中出現(xiàn)任何失誤，將很可能會導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能的顯著下降，并隨后會導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失，因此需要有一個能夠確認(rèn)成品飼料中酶的存在及其含量的正式且精確的分析方法。

1 酶含量的檢測

然而，盡管每年用于釋放飼料原料中養(yǎng)分或降低抗?fàn)I養(yǎng)作用的飼用酶費用超過7億萬美元，但檢測成品日糧中酶的實驗室檢測方法到今仍因昂貴的成本且費時而其應(yīng)用受到限制。不僅如此，雖然目前有公認(rèn)的植酸酶的通用質(zhì)量控制方法，而木聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶或淀粉酶卻沒有類似的方法。

在大多數(shù)情況下，檢測方法的開發(fā)主要是為了滿足某些監(jiān)管部門的需求，如歐盟的相關(guān)部門，而對飼料行業(yè)的需求不太重視，后者需要可靠、精確且操作方便、具有成本效益的檢測方法。該結(jié)果是出現(xiàn)了許多生產(chǎn)商和某些產(chǎn)品專用的分析方法，這些方法通常難以獨立運用且成本高，這對需要能夠快速、簡便、精確和低成本檢測方法的飼料生產(chǎn)商或終端用戶來說幾乎不實用。

另外，目前實驗室使用的分析方法往往對實驗條件，如pH值、溫度和所用反應(yīng)物的組成成分，微小的變化非常敏感。結(jié)果是不同實驗室測得的酶活性很可能差異巨大，導(dǎo)致飼料生產(chǎn)商在需要進(jìn)行質(zhì)量保證檢測時，每次除了將樣本送回酶供應(yīng)商外幾乎難以做出其他選擇。

2 檢測方法的局限性

這種情況很不理想，是AB Vista公司開發(fā)一種可以提高飼用酶檢測標(biāo)準(zhǔn)（通過克服這些基本問題同時避免目前限制現(xiàn)有檢測方法的許多不足）的檢測手段的驅(qū)動力。例如，先前的方法通常依賴于酶在某些固定條件，如pH、溫度、時間和底物濃度下與特定底物相互的作用，隨后對最終釋放出的終產(chǎn)物進(jìn)行定量。

換言之，此類方法僅能在一組特定的預(yù)定條件下檢測酶的活性，因此幾乎不可能鑒別飼料原料中添加酶和內(nèi)源性酶所產(chǎn)生的活性，即使這些內(nèi)源性酶在動物體內(nèi)效應(yīng)有限，但是添加酶以受飼料中抑制因子的影響而限制了其作用。

同樣受到關(guān)注的是以下事實，即盡管這一方法需要配制相當(dāng)先進(jìn)的實驗室設(shè)備和大約一天的時間方能完成，但其仍不能鑒別不同來源的同類型的酶。在商業(yè)性條件下，酶在動物體內(nèi)的效應(yīng)相差很大，具體取決于其特性，而酶的特性因來源和開發(fā)條件的不同而各異?？梢杂媒^對正確的方法鑒定某種特定酶的能力是非常重要的。

本文還應(yīng)指出，非基于實驗室的分析方法能夠正確地預(yù)測酶在動物體內(nèi)的作用。在試管中復(fù)制目標(biāo)動物精確的胃腸道環(huán)境簡直是不可能的，試管存在能夠限制出于基本質(zhì)量控制目的的任何體外分析方法的局限性。

3 ELISA方法的開發(fā)

出于這些原因，AB Vista公司與英國的酶服務(wù)與咨詢公司（Enzyme Services and Consultancy）的研究人員合作，采用了一種極為不同的方法，以便為能夠直接測定飼料中酶及其活性的飼用酶分析方法建立一種新的標(biāo)準(zhǔn)。由此獲得的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是基于通過利用一種具有很強(qiáng)針對性及高度準(zhǔn)確性的特定抗體—即特定飼用酶的活性形式，捕捉并固定目標(biāo)蛋白的原理（圖1）。

利用為特定飼用酶開發(fā)的每一種ELISA方法，該抗體專為匹配位于或靠近完整活性位點上該蛋白質(zhì)的一部分設(shè)計的。這可避免誤檢飼料加工中甚至部分已變性的任何酶，并能確保不受內(nèi)源性酶和不同來源的其他添加酶的影響。這本身是飼用酶檢測精度上的一個巨大的進(jìn)步。

隨后，捕獲的蛋白質(zhì)（即目標(biāo)酶）可利用二次反應(yīng)法（—可產(chǎn)生一種能與規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較以確定酶水平的顏色），對酶的存在及含量進(jìn)行定量。這是一種快速、低成本、高精確的方法，能夠在世界各地的任何地方進(jìn)行，有較高的重復(fù)性，對實驗和環(huán)境條件改變的敏感性低于早先的方法。

每一種ELIAS方法還可用于僅對酶進(jìn)行快速的檢測，或?qū)γ负窟M(jìn)行實際的定量，檢測時無需配備任何復(fù)雜的設(shè)備或?qū)I(yè)的檢測人員。

4 獨特的優(yōu)點

這是一種獨特的方法，且這種新的檢測標(biāo)準(zhǔn)已被證明非常成功，因為AB Vista公司早先推出的Quantum植酸酶 ELISA分析法現(xiàn)在加入了Econase XT木聚糖酶的新ELISA方法。對這二種酶，二種類型的ELISA檢測試驗盒已經(jīng)完成開發(fā)，第一個是QuickStix橫向流快速檢測試劑盒，可在5 min內(nèi)對活性酶的商業(yè)水平進(jìn)行定量測定。

QuickStix檢測試劑盒能夠檢測小到單個飼料顆粒中的酶含量，成為飼料生產(chǎn)商出色的質(zhì)量控制工具，同時它還能證明在通過胃腸道時酶活性的保留情況。每個QuickStix上的二個紅色指標(biāo)標(biāo)記能夠與飼料樣本的提取物發(fā)生反應(yīng)，上一條紅線可證實QuickStix正發(fā)揮著恰當(dāng)?shù)墓δ?，而下一紅線的顏色強(qiáng)度與Econase XT木聚糖酶活性水平呈正比例。

第二個試劑盒是QuantiPlate微滴度試劑盒，能對商用飼料中正常含量內(nèi)的酶活性進(jìn)行正確的定量（圖1）。在3 h內(nèi)能夠獲得正確的檢測結(jié)果，它被設(shè)計成操作簡便且易懂。

5 檢測結(jié)果確認(rèn)

為確認(rèn)該結(jié)果的精確性和重復(fù)性，研究人員添加0 U/kg （圖1中樣本1）～48 000 U/kg（圖2中樣本8） Econase XT木聚糖酶的一系列飼料用ELISA QuantiPlate方法和標(biāo)準(zhǔn)濕化學(xué)分析法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示QuantiPlate檢測結(jié)果與根據(jù)添加量預(yù)測的飼料中酶含量間極為一致（R2>0.99，P<0.001），證實了這一新的檢測方法的穩(wěn)定性和價值（圖2）。濕化學(xué)法獲得的較高結(jié)果是由于其還檢測出了大約3 000 U/kg的內(nèi)源性酶活性，而新的QuantiPlate分析法則忽略了這一活性。

很顯然，Econase XT 的QuantiPlate和QuickStix檢測法在建立新的、高標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)濟(jì)合算且操作方便的木聚糖酶檢測方法上起著重要的作用。對那些正在尋找有效質(zhì)量控制和有保障的程序且盡可能降低對昂貴且費時的實驗室檢測方法的飼料生產(chǎn)商而言，毫無疑問向前邁出了非常實質(zhì)性的一步?！酢?/p>

原題名：Cost-effective and convenient xylanase enzyme analysis（英文）

原作者：Hadden Graham博士（AB Vista公司技術(shù)總監(jiān)）、Noel Sheehan（酶服務(wù)與咨詢公司經(jīng)理）