紫花苜蓿玀sCOL1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

蘇志芳等

摘要[目的]構(gòu)建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表達(dá)載體。[方法]根據(jù)紫花苜蓿CONSTANS類(lèi)似基因MsCOL1基因（登錄號(hào)：DQ661682）序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的一對(duì)特異性引物，以紫花苜蓿cDNA為模板，獲得MsCOL1基因完整編碼區(qū)DNA序列，并將目的片段插入表達(dá)載體pBI121的相應(yīng)位置，構(gòu)建植物表達(dá)載體35S∷MsCOL1，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將35S∷MsCOL1轉(zhuǎn)化到擬南芥中。[結(jié)果]分析測(cè)序結(jié)果顯示，所獲得克隆為插入目的片段的陽(yáng)性克隆。經(jīng)RTPCR 檢測(cè)，證明轉(zhuǎn)基因植株中MsCOL1基因能夠順利表達(dá)。[結(jié)論]該方法成功構(gòu)建植物表達(dá)載體35S∷MsCOL1，并獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

關(guān)鍵詞紫花苜蓿；擬南芥；轉(zhuǎn)基因；MsCOL1

中圖分類(lèi)號(hào)S541+.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）06-01610-02

Abstract[Objective] To construct plant expression vector of MsCOL1 gene from alfalfa. [Method] Based on the sequence of alfalfa CONSTANSLike 1 （MsCOL1） gene （Access No.： DQ661682）， two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of fulllength cDNA， the coding domain sequence of MsCOL1 was obtained， which was inserted into the restrict sites of expression vector pBI121， resulting plant expression vector 35S：：MsCOL1. Mediated by Agrobacterium tumefaciens， 35S：：MsCOL1 was transformed into Arabidopsis thaliana. [Result] PCR testing showed that 15 transgenic plants were obtained. [Conclusion] These results indicated that the plant expression vector 35S：：MsCOL1 was constructed and transgenic Arabidopsis plants with MsCOL1 gene were obtained successfully.

Key wordsAlfalfa； Arabidopsis thaliana； Transgene； MsCOL1

有關(guān)植物開(kāi)花時(shí)間的分子生物學(xué)研究，在模式植物擬南芥上已經(jīng)進(jìn)行得相對(duì)全面、深入。在調(diào)控?cái)M南芥開(kāi)花時(shí)間的光周期途徑中，CONSTANS（CO）基因的表達(dá)控制擬南芥感知日照時(shí)間的長(zhǎng)短，在連接光信號(hào)與生物信號(hào)過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，該基因編碼一個(gè)含有鋅指結(jié)構(gòu)的核蛋白[1]。當(dāng)植物受到長(zhǎng)時(shí)間光照時(shí)，CO基因的mRNA表達(dá)量增加[2]。CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)植物開(kāi)花。在擬南芥開(kāi)花時(shí)間有關(guān)基因調(diào)控研究中，CO基因突變體能使開(kāi)花時(shí)間延遲，通過(guò)調(diào)節(jié)增加CO基因的表達(dá)，可以使FT基因的表達(dá)量提高，使植物開(kāi)花行為提前發(fā)生[1]。但是在CO基因的同源基因COL的表達(dá)模式中，功能有所差異。過(guò)表達(dá)COL1基因只能使其晝夜節(jié)律明顯縮短，但對(duì)植物開(kāi)花時(shí)間沒(méi)有產(chǎn)生干擾；COL2基因的表達(dá)量對(duì)植物開(kāi)花時(shí)間沒(méi)有干擾[4]；COL3基因的表產(chǎn)物對(duì)紅色波長(zhǎng)信號(hào)敏感，并且能使根部細(xì)胞生長(zhǎng)加快[6]。COL9基因的超量表達(dá)能使植物延遲開(kāi)花[5]。相關(guān)研究結(jié)果表明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法將擬南芥CO基因?qū)腭R鈴薯中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，使馬鈴薯的帶花現(xiàn)象延遲[7]。此外，水稻中的一個(gè)CO的同源基因OsCO3在水稻中過(guò)表達(dá)時(shí)能導(dǎo)致水稻開(kāi)花推遲[8]。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育中，開(kāi)花時(shí)間是一個(gè)非常重要的生理事件。開(kāi)花時(shí)間受到多種基因調(diào)控。已克隆的與開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因僅在擬南芥、水稻等少數(shù)幾種植物中成功獲得。通過(guò)對(duì)這些基因進(jìn)行分析，種間的CO基因存在較高的保守性，但其在作用機(jī)理上卻存在較大差異。此外，由于CO基因在植物中屬于一個(gè)包含多拷貝的基因家族，這個(gè)家族中其他拷貝的基因是否與調(diào)控開(kāi)花時(shí)間有關(guān)還不是很清楚，故仍需深入研究。為了揭示植物開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)，需要對(duì)開(kāi)花時(shí)間相關(guān)基因的作用機(jī)理及互作模式進(jìn)行深入研究。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過(guò)構(gòu)建使目標(biāo)基因過(guò)量表達(dá)的DNA載體，將其轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因功能。筆者將構(gòu)建的紫花苜蓿MsCOL1基因過(guò)量表達(dá)載體，應(yīng)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，以期為研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒。大腸桿菌菌株為E.coli DH5α，購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司；克隆載體 pMD19T與植物表達(dá)載體pBI121，由內(nèi)蒙古巴彥淖爾市農(nóng)科院畜牧所惠贈(zèng)；農(nóng)桿菌菌株GV3101，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及DNA回收試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker和 Tap DNA聚合酶，購(gòu)自北京天根生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2.3MsCOL1基因表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定。利用質(zhì)粒小提試劑盒，對(duì)含有正確MsCOL1基因序列的大腸桿菌，提取質(zhì)粒，使用XbaI和BamHI雙酶切，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)分別回收目的片段后，使用T4連接酶16 ℃連接6 h后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH 5α，在含有50 mg/L卡納霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR鑒定，以CO1f和CO1r為引物；然后將含有目的條帶的菌液送至北京三博遠(yuǎn)志測(cè)序鑒定。構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為35S∷MsCOL1。

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥及其鑒定。提取35S∷MsCOL1質(zhì)粒并純化，用CaCl2凍融法將重組子導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。利用花序浸泡法，對(duì)處于花蕾期的野生型擬南芥進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，具體步驟為：將已經(jīng)長(zhǎng)出腋生花序的擬南芥植株在含有pBINCED4的農(nóng)桿菌菌液浸泡約5 min，罩上塑料袋，在恒溫箱中放置，暗培養(yǎng)24 h，一周后再次浸入農(nóng)桿菌懸浮液浸染，溫室中待擬南芥生長(zhǎng)成熟。收集擬南芥種子，在無(wú)菌條件下，將擬南芥種子用70%酒精浸泡10 min后，用蒸餾水清洗，然后均勻撒在含有50 mg/L卡那霉素1/2Ms培養(yǎng)基上。15 d后，選取正常生長(zhǎng)的擬南芥幼苗，轉(zhuǎn)移到土中，繼續(xù)生長(zhǎng)。

1.2.5再生植株檢測(cè)。采用CTAB法提取抗性苗基因組DNA，以CO1f和CO1r為引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1紫花苜蓿MsCOL1基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定以紫花苜蓿第一鏈cDNA為模板，以引物CO1f和CO1r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。PCR產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與克隆載體pMD19T載體連接。轉(zhuǎn)化后，挑取陽(yáng)性克隆鑒定并測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果顯示，所獲得克隆為插入目的片段的陽(yáng)性克隆。

具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi載體pARTSA使紫花苜蓿的MsCOL1基因表達(dá)量有所下降[9]。張威威等構(gòu)建了銀杏pCAMBIA1304GbCOab表達(dá)載體，用轉(zhuǎn)基因來(lái)研究CO基因功能是一種常用的方法，該方法已經(jīng)在很多實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用[10]。

試驗(yàn)為了構(gòu)建MsCOL1基因超表達(dá)載體，通過(guò)PCR擴(kuò)增的方式在目的基因開(kāi)放閱讀框兩端分別引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，保證了連接方向的準(zhǔn)確性。將分離到的基因構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，得到成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因苗，進(jìn)一步研究了MsCOL1基因及NCED4基因的功能。試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥，并通過(guò)PCR反應(yīng)與未轉(zhuǎn)化的植株對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果顯示所轉(zhuǎn)化的4株全部為陽(yáng)

性，證實(shí)目的基因已轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中。研究將構(gòu)建的MsCOL1基因過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)該基因功能的研究具有重要的價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] ROBSON F，COSTA M M R，HEPWORTH S R，et al.Functional importance of conserved domains in the floweringtime gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants[J].The Plant Journal，2001，28（6）：619-631.

[2] SUAREZLOPEZ P，WHEATLEY K，ROBSON F，et al.CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis[J].Nature，2001，410（6832）：1116-1120.

[3] LEE H，SUH S S，PARK E，et al.The AGAMOUSLIKE 20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways in Arabidopsis[J].Genes Dev，2000，14（18）：2366-2376.

[4] LEDGER S，STRAYER C，ASHTON F，et al.Analysis of the function of two circadianregulated CONSTANSLIKE genes[J].Plant J，2001，26（1）：15-22.

[5] CHENG X F，WANG Z Y.Overexpression of COL9，a CONSTANSLIKE gene，delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，2005，43（5）：758-768.

[6] DATTA S，HETTIARACHCHI G H C M，DENG X W，et al.Arabidopsis CONSTANSLIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth[J].The Plant Cell Online，2006，18（1）：70-84.

[7] GONZLEZSCHAIN N，SUREZLPEZ P.CONSTANS delays flowering and affects tuber yield in potato[J].Biologia Plantarum，2008，52（2）：251-258.

[8] KIM S K，YUN C H，LEE J H，et al.OsCO3，a CONSTANSLIKE gene，controls flowering by negatively regulating the expression of FTlike genes under SD conditions in rice[J].Planta，2008，228（2）：355-365.

[9] 周光輝，楊青川，張鐵軍，等.紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化[J].中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2013，35（4）：7-12.

[10] 張威威，寧迎晶，陳柳吉，等.銀杏CONSTANS基因植物表達(dá)載體構(gòu)建[J].生物技術(shù)，2010，20（6）：8-10.