胡椒油樹脂抗氧化性及抑菌性研究

劉笑　包振偉　顧林

摘要[目的]研究胡椒油樹脂的抗氧化性及抑菌性。[方法]采用超聲波輔助法提取黑、白胡椒油樹脂，分別測定了2種胡椒油樹脂的還原力、對DPPH·的清除力、抑制油脂過氧化能力以及抑菌活性。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，2種胡椒油樹脂的還原力相當(dāng)，對DPPH·自由基有著較好的清除效果，濃度達(dá)到2 mg/ml后，清除率達(dá)到80%；黑、白胡椒油樹脂對豬油和芝麻油2種油脂均具有較好的抗氧化作用，其抗氧化效果隨胡椒油樹脂濃度的增大而增強(qiáng)；黑、白胡椒油樹脂對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌均具有良好的抑制能力，最小抑菌濃度分別為7.5、7.5、15.0 mg/ml。[結(jié)論] 研究可為胡椒油樹脂的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞胡椒油樹脂；還原力；抗氧化；抑菌

中圖分類號S509.9；TS202.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）09-02731-04

基金項(xiàng)目“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD33B01）。

作者簡介劉笑（1991- ），女，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。*通訊作者，教授，從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏研究。

自由基是生物體內(nèi)新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類具有高度活性的物質(zhì)，含有未配對電子的物質(zhì)[1]，過量的自由基能導(dǎo)致生物膜、酶、維生素、蛋白質(zhì)及活細(xì)胞功能過氧化損傷，從而引發(fā)多種疾病，如腫瘤、動脈粥樣硬化、心血管疾病等，對生物體危害很大。油脂和富含油脂的食品容易發(fā)生自動氧化，導(dǎo)致油脂出現(xiàn)哈敗，嚴(yán)重影響油脂及食品的風(fēng)味、色澤及組織，對油脂及食品品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，縮短貨架期，甚至危害人體的健康。食品在加工及貯藏過程中很容易受到微生物的污染而導(dǎo)致腐敗，影響食品的貨架期，食用腐敗變質(zhì)的食品會對人體的肝臟、腎臟造成嚴(yán)重傷害，甚至可能引起癌癥等疾病，對人體的生命造成威脅。食品工業(yè)中常采用人工合成的防腐劑來延緩食品腐敗變質(zhì)，但是長時間使用化學(xué)防腐劑也會導(dǎo)致畸形或慢性中毒等后果，因此亟需尋找高效的天然防腐劑和保鮮劑來替代人工防腐劑[2]。研究表明，某些植物的提取物能夠有效抑制微生物的生長，作為防腐劑使用不僅安全無毒、性能穩(wěn)定而且還能增加食物營養(yǎng)成分。近年的研究顯示，一些植物的揮發(fā)性油、生物堿、酚類、不飽和長鏈脂肪酸等具有較強(qiáng)的抑菌性[3]。胡椒作為重要的香辛料之一，含有很多功能性物質(zhì)，如胡椒精油、胡椒油樹脂、月桂酸、硬脂酸等[4]，這些功能性物質(zhì)能夠瘦身[5]，減少炎癥和疼痛[6-8]，保護(hù)肝臟，有效清除自由基[9]，減緩油脂自氧化[10]能力，還能有效抑制微生物的生長[11]，可以用作防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑等。

1材料與方法

1.1材料黑、白胡椒油樹脂，以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助法浸提所得[12]。主要試劑：無水乙醇、DPPH·自由基、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸，均為分析純。主要儀器和設(shè)備：UV2401 PC紫外可見分光光度計(jì)，日本Shimadu公司；HH6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；DGF30/7IA 電熱鼓風(fēng)干燥箱，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，日本TUMY公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DPPH·自由基清除能力。在10 ml試管中分別加入各濃度胡椒油樹脂溶液2 ml及2.5×10-4 mol/L DPPH·2 ml，搖勻，暗處靜置，30 min后于波長517 nm 下測定其吸光度Ai；同時測定2 ml DPPH·（2×10-4 mol/L，無水乙醇配置）溶液和2 ml無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 ml測定液與2 ml無水乙醇混合液的吸光度Aj，根據(jù)下式計(jì)算測定液對DPPH·的抑制率[13]。

抑制率（%）=（1-Ai-AjAc）×100%

1.2.2還原能力。采用普魯士藍(lán)法，取不同濃度梯度的樣品溶液1.0 ml，加入2.5 ml的pH為6.6的磷酸緩沖液，2.5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min，然后加入2.5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，振蕩混勻后，3 000 r/min離心10 min，取上清液5 ml，加入5 ml蒸餾水和1.0 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，混勻后反應(yīng)10 min，在波長700 nm處測定吸光值，并以相同濃度的VC水溶液做對照，吸光值越高，抗氧化性越好，還原力越強(qiáng)[14-16]。

1.2.3抗脂質(zhì)過氧化能力。分別稱20 g豬油和麻油6份置于100 ml具塞錐形瓶中，1份為空白對照組，4份分別添加2.0 ml胡椒油樹脂溶液，1份加入0.2 mg VC作為陽性對照，混合均勻。置于（60±1）℃的烘箱中，每隔12 h攪拌1次，并且交換烘箱中內(nèi)外錐形瓶的位置。每隔2 d取樣檢測豬油和麻油的過氧化值（POV）。

過氧化值的測定參考GB/T 5009.37-2003第一法：準(zhǔn)確稱取2～3 g混勻的樣品，置于碘量瓶（250 ml）中，加入30 ml三氯甲烷-冰乙酸混合液（量取40 ml三氯甲烷，加60 ml冰乙酸混勻），立即搖動使樣品完全溶解。加入1.0 ml飽和碘化鉀溶液（稱取14.0 g碘化鉀，加10.0 ml水溶解，必要時微熱使其溶解，冷卻后貯于棕色瓶中），加塞后輕輕振蕩30 s，放置暗處3 min。取出加水100 ml，搖勻，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度0.002 mol/L）滴定，待溶液變成淡黃色時，加入10 ml淀粉指示劑（10 g/L），繼續(xù)滴定至溶液的藍(lán)色消失為終點(diǎn)[17-19]。清除率按下列公式計(jì)算：

1.2.4抑菌能力。

1.2.4.1試驗(yàn)菌種。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（salmonella），由揚(yáng)州現(xiàn)代乳品加工中心微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.4.2培養(yǎng)基配制。LB培養(yǎng)基：1 000 ml錐形瓶中加入氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，酵母汁5 g，加水至1 000 ml，氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，封裝于試管中，121 ℃下滅菌15 min，即為LB液體培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基的制備是在液體培養(yǎng)基里加入瓊脂（15 g/L）即可。

1.2.4.3菌懸液的制備。從4 ℃冰箱中取出菌種，用接種環(huán)挑取適量置于裝有10 ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，混勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，此為一代菌；繼續(xù)從一代菌的菌液中吸取適量至裝有10 ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，即為二代菌。移取1 ml二代菌液到裝有9 ml無菌水的試管中，混勻，再從該試管中移取1 ml菌液到另一個裝有9 ml無菌水的試管中，以此類推，得到不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，直至菌懸液濃度大約為107～108 CFU/ml，即為所需菌懸液，置于冰箱4 ℃保存待用。

1.2.4.4抑菌試驗(yàn)。采用瓊脂打孔法[20]，將滅過菌的LB固體培養(yǎng)基加熱成液態(tài)，趁熱倒入培養(yǎng)皿中，靜置冷卻，即為LB平板。吸取0.1 ml 菌懸液（108 CFU/ml）于平板上，用涂布棒將菌懸液涂布均勻，待菌液揮發(fā)至干，用滅菌后的打孔器（直徑11 mm）在每個平板打3個孔，除去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，使平板上的打孔處的中央形成一個凹面。在凹面內(nèi)滴入不同濃度的胡椒油樹脂丙酮溶液，用丙酮做空白對照試驗(yàn)。將平板轉(zhuǎn)移到37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4.5最小抑菌濃度（MIC）確定。采用2倍稀釋法[21]，以丙酮作為溶劑，將胡椒油樹脂配制成一系列梯度濃度的溶液，加入已融化好的培養(yǎng)基中，混合均勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，平板劃線接種，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，與對照組（僅添加丙酮溶劑）比較，肉眼可見有菌落生長為無抑制作用，肉眼可見完全無菌落生長的最小質(zhì)量濃度作為MIC，以丙酮溶劑作對照。

2結(jié)果與分析

2.1胡椒油樹脂對DPPH·的清除作用從圖1可以看出，隨著濃度的增加，黑胡椒油樹脂和白胡椒油樹脂對DPPH·的清除率均逐漸增加，在1 mg/ml時清除率就超過50%，而濃度達(dá)到2 mg/ml后，清除率達(dá)到80%，此后基本保持不變。陽性對照VC對 DPPH·的清除率基本保持在80%以上。黑胡椒油樹脂的清除效果略好于白胡椒油樹脂，并且當(dāng)兩者濃度在2 mg/ml時和VC的清除效果相近?？梢?，黑胡椒油樹脂和白胡椒油樹脂對DPPH·均有著良好的清除效果。

2.2胡椒油樹脂的還原能力由圖2可以看出，黑胡椒油樹脂和白胡椒油樹脂的還原能力隨著濃度的增加基本保持恒定，且兩者相差很小，而陽性對照VC的還原能力隨著濃度的增加逐漸加強(qiáng)，在濃度達(dá)到1.0 mg/ml后基本保持恒定。與VC相比，2種胡椒油樹脂的還原能力較弱。

2.3胡椒油樹脂對油脂抗氧化作用

2.3.1黑胡椒油樹脂對豬油抗氧化作用。由圖3可以看出，添加黑胡椒油樹脂的樣品的過氧化值均低于空白樣品（不添加胡椒油樹脂），且隨著添加量的增加，黑胡椒油樹脂對豬油的抗氧化效果逐漸加強(qiáng)，空白樣品在第4天過氧化值就超過20 meq/kg（食用油理化指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)），而添加了8 mg黑胡椒油樹脂的樣品直到第8天過氧化值才超標(biāo)，且與陽性對照VC相比，對豬油的抗氧化能力相差較小。由此可見，黑胡椒油樹脂對豬油具有良好的抗氧化效果。

圖3黑胡椒油樹脂對豬油氧化的過氧化值的影響2.3.2白胡椒油樹脂對豬油抗氧化作用。由圖4可以看出，不同濃度的白胡椒油樹脂對豬油均具有一定的抗氧化作用，隨著添加量的增加，白胡椒油樹脂對豬油的抗氧化效果逐漸加強(qiáng)，添加了8 mg的樣品在第6天過氧化值還低于20 meq/kg，而空白第4天就超標(biāo)了。但是對于相同添加量的油樹脂，白胡椒油樹脂的抗脂質(zhì)過氧化能力低于黑胡椒油樹脂。可見，白胡椒油樹脂對豬油具有一定的抗氧化作用。

2.3.3黑胡椒油樹脂對麻油抗氧化作用。由圖5可以看出，空白樣品在第8天過氧化值超標(biāo)，添加了不同量的黑胡椒油樹脂樣品在第8天仍然能夠符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。圖5中各條曲線的緊密程度反映出各個樣品過氧化值相近相差程度，可以看出，在第8天之前，隨著油樹脂添加量的增加，麻油的過氧化值變化相差不大，各條線比較緊密。添加了8 mg黑胡椒油樹脂的樣品與添加陽性對照VC的樣品氧化程度幾乎一樣，在第10天均未超標(biāo)?？梢?，黑胡椒油樹脂對麻油氧化作用具有較好的抑制效果。

2.3.4白胡椒油樹脂對麻油抗氧化作用。圖6反映了不同添加量的白胡椒油樹脂對麻油氧化的抑制效果。和黑胡椒油樹脂相似，隨著添加量的增加，樣品的過氧化值增長速度逐漸降低，2 mg黑胡椒油樹脂添加量的樣品在第6天符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，第8天過氧化值超標(biāo)，而8 mg白胡椒油樹脂添加量的樣品直到第10天才略微超標(biāo)，且與陽性對照VC的效果相近。但是和黑胡椒油樹脂效果相比，白胡椒油樹脂對麻油的抗氧化效果略差，相同添加量時對麻油氧化的抑制作用略小于黑胡椒油樹脂。

2.4胡椒油樹脂體外抑菌

2.4.1黑胡椒油樹脂體外抑菌。表1是不同濃度黑胡椒油樹脂對3種致病菌：金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的抑制效果，效果通過抑菌圈的直徑顯示，抑菌圈直徑越大，抑制效果越強(qiáng)。從表1中可以看出，隨著胡椒油樹脂濃度的降低，3種菌收到的抑制效果均逐漸下降，可以得出抑菌效果和胡椒油樹脂濃度正相關(guān)。對比相同油樹脂濃度時3種受試菌的抑菌圈直徑可以發(fā)現(xiàn)，黑胡椒油樹脂對3種受試菌的抑制效果為：金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>大腸桿菌。由此可見，黑胡椒油樹脂具有良好的抑菌性。

2.4.2白胡椒油樹脂體外抑菌。由表2可以看出，和黑胡椒油樹脂相似，抑菌效果和白胡椒油樹脂濃度正相關(guān)，濃度越低，抑菌效果越差。白胡椒油樹脂對3種受試菌的抑制效果為：金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>大腸桿菌。對比表1和2可以得出，白胡椒油樹脂的抑菌效果略低于黑胡椒油樹脂，尤其在濃度較低時，兩者抑菌效果相差較大?？梢缘贸?，在適當(dāng)?shù)臐舛认拢诤酚蜆渲桶缀酚蜆渲休^好的抑菌性。

2.4.3胡椒油樹脂的最小抑菌濃度。從表3可以看出，2種胡椒油樹脂的最小抑菌濃度相同，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌最小抑菌濃度分別為7.5、7.5、15.0 mg/ml。2種胡椒油樹脂對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌均具有良好的抑制能力。

3結(jié)論

以黑白胡椒油樹脂為原料，通過測定其對DPPH·自由基的清除能力、還原力、抗脂質(zhì)過氧化能力以及對3種常見致病菌的抑制能力，測定其抗氧化活性及體外抑菌活性，得出以下結(jié)論：①DPPH·自由基清除力。黑胡椒油樹脂的清除效果略好于白胡椒油樹脂，當(dāng)兩者濃度在2 mg/ml時和VC的清除效果相近，清除率達(dá)到80%以上。兩者對DPPH·自由基均具有良好的清除能力。②還原能力。黑胡椒油樹脂和白胡椒油樹脂還原能力相當(dāng)，與陽性對照相比，相對較弱，還原能力不強(qiáng)。③抗脂質(zhì)過氧化能力。黑胡椒油樹脂的對豬油和麻油的抗氧化能力均強(qiáng)于白胡椒油樹脂，添加了胡椒油樹脂的麻油和豬油樣品可以增加保質(zhì)期，延長貨架期。考慮到成本的問題，在食用油中只需按8 mg/20 g油的比例添加胡椒油樹脂，可以達(dá)到與VC相近的效果。④體外抑菌活性。黑胡椒油樹脂和白胡椒油樹脂對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌，最小抑菌濃度分別為7.5、7.5、15.0 mg/ml，當(dāng)濃度達(dá)到0.10 g/ml時，抑菌圈直徑均在11 mm以上，可見黑白胡椒油樹脂均具有較好的抑菌能力。

參考文獻(xiàn)

[1] HAMILTON R J，KALU C，PRISK E，et al.Chemistry of free radicals in lipids[J].Food Chemistry，1997，60（2）：193-199.

[2] 于智峰，趙立慶，鄭君君，等.天然防腐劑在肉制品中的應(yīng)用[J].中國調(diào)味品，2012，37（3）：12-21.

[3] KHAN M R，KIHARA M，OMOLOSO A D.Antimicrobial activity of the alkaloidal constituents of the root bark of Eupomatia laurina[J].Pharmaceut Biol.，2003，41（4）：277-280.

[4] 鄔華松，楊建峰，林麗云.中國胡椒研究綜述[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（7）：2469-2480.

[5] 王穎，姜子濤，李榮.黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力的比較[J].中國調(diào)味品，2009，34（5）：50-53.

[6] GUPTA S K，BANSAL P，BHARDWABJ R K，et al.comparative antinociceptive，antiinflammatory and toxicity profile of nimesulide vs nimesulide and piperine combination[J].Pharmacological Research，2000，41（6）：657-662.

[7] LEE E B，SHIN K H，WOO W S.Pharmacological study of piperine [J].Arch Pharm Res，1984，7（2）：127-132.