SPAG9 在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

陳燦堅(jiān) 尹朝暉

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在中國則占據(jù)常見惡性腫瘤的第3～4 位，其發(fā)病率和病死率均有逐年上升的趨勢[1]。由于目前對結(jié)直腸癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，早期診斷和預(yù)后檢測也不夠完善，因此研究結(jié)直腸癌的早期腫瘤標(biāo)志物以及探尋以分子生物學(xué)為靶點(diǎn)的治療途徑成為熱點(diǎn)，這些研究將有助于對結(jié)直腸癌的早期臨床診斷、指導(dǎo)治療和評價(jià)預(yù)后；并且為進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

精子相關(guān)抗原9(Sperm-associated antigen 9，SPAG 9)是癌睪丸抗原（Cancer-testis antigen，CTA)家族的新成員，在睪丸組織中特異性表達(dá)；近年來研究發(fā)現(xiàn)其與多種惡性腫瘤相關(guān)，如腎癌[2]、宮頸癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]、甲狀腺癌[5]等。SPAG9 作為支架蛋白與c-jun N端激酶(c-jun NH 2-terminal kinase，JNK)相互作用，通過調(diào)節(jié)與之相關(guān)的MAPK組件的信號強(qiáng)度發(fā)揮作用[6-8]，從而調(diào)控人體多種生理功能，并與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)；而且JNK已被證實(shí)可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的生長[9-10]，推測腫瘤組織高表達(dá)SPAG9 蛋白可通過改變MAPK信號通路的強(qiáng)度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。目前有關(guān)此基因在結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)情況的報(bào)道尚少，因此本文采用免疫組化法對結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌和結(jié)直腸正常組織SPAG9 蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，以探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2011 年9 月-2013 年2 月汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科手術(shù)切除（或結(jié)腸鏡下息肉切除）且經(jīng)病理診斷的結(jié)直腸組織69 例，結(jié)直腸腺瘤18 例，臨床資料完整，其中男48 例，女39 例；年齡30～86 歲，平均年齡60 歲。結(jié)直腸癌病理分級(按WHO標(biāo)準(zhǔn))：I 級12 例，II 級29 例，Ⅲ級21 例，IV 級7 例，腺瘤18 例；全部病例術(shù)前均未行放、化療。對照組為汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室切取的意外死亡者正常結(jié)腸組織標(biāo)本20 例，所有標(biāo)本均由本院病理科醫(yī)師復(fù)核分級。

1.2 主要試劑 兔抗人SPAG9 多克隆抗體購（Abcam公司，美國），即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒（鼠/兔）和DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化采用即用型快捷免疫組化MaxVision法。所有組織均經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片4 μm厚，脫蠟和水化后，3%過氧化氫溶液處理，PBS沖洗3 次，3 min/次；在EDTA抗原修復(fù)液（PH 8.0）中進(jìn)行抗原修復(fù)8 min；每張切片加1 滴3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每張切片加1 滴1∶200 稀釋的一抗(兔抗人SPAG9多克隆抗體)，4℃過夜；PBS沖洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每張切片加1 滴即用型快捷免疫組化MaxVision試劑，室溫下孵育20 min，BS沖洗3 次，3 min/次；除去PBS液，每張切片加2 滴新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～5 min；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)，DAB顯色，脫水、透明、封片。陽性對照為睪丸組織，PBS代替一抗作陰性對照，其他步驟與待測標(biāo)本相同。

1.3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)免疫組化結(jié)果采用半定量積分法分析，每例切片選5 個(gè)高倍視野，觀察細(xì)胞著色百分率和細(xì)胞質(zhì)的著色程度，取其均值，按陽性細(xì)胞數(shù)占同視野計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比，≤5%為0 分；5%～25%為1 分；25%～50%為2 分；50%～75%為3 分；75%為4 分。陽性強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈色為準(zhǔn)，未著色為0 分，淡黃色為1 分，橙褐色為2 分，棕褐色為3 分。兩者相乘0 分為(-)，1～3 分為(+)，4～5 分為(++)，≥6 分為(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間SPAG9 陽性率用χ2檢驗(yàn)，方差分析檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

SPAG9 在20 例正常結(jié)直腸及69 例癌旁組織中均不表達(dá)，而在腺瘤及結(jié)直腸癌標(biāo)本中高表達(dá)，腺瘤表達(dá)陽性率77.8%（14/18），結(jié)直腸癌表達(dá)陽性率為81.2%（56/69)；SPAG9 在腺瘤與結(jié)直腸癌的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SPAG9 蛋白表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞膜及胞漿，呈淡黃色或棕褐色，腫瘤間質(zhì)未見明顯表達(dá)（見圖1)。SPAG9 的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、血清CEA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分級均無明顯的相關(guān)關(guān)系，而與臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在早期結(jié)直腸癌為I+II(92.7%)、進(jìn)展期結(jié)直腸癌為III+IV(64.3%)，P＜0.05。表1 示，SPAG9 在腺瘤表達(dá)陽性率77.8%（14/18），結(jié)直腸癌表達(dá)陽性率為81.2%（56/69)。

圖1 免疫組化檢測ASPAG9 蛋白在結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌（按臨床期別）的表達(dá)情況（×200）

表1 SPAG9 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

癌睪丸抗原CTA是一類具有特異性表達(dá)模式的腫瘤相關(guān)抗原，主要表達(dá)于睪丸的生殖細(xì)胞、卵子及胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤組織中有不同程度的表達(dá)。Zendman等[11]認(rèn)為其可能參與細(xì)胞信號通路傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄及翻譯、染色體重排。在惡性腫瘤組織中，該類抗原的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的無限增殖、遷移、侵襲能力及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。

SPAG9 蛋白是CTA家族的一員，SPAG9 編碼的蛋白與JNK相互作用蛋白（JNK interacting protein，JIP）具有結(jié)果同源性，且氨基端有JNK結(jié)合位點(diǎn)，被認(rèn)為是JIP家族的一員。研究證實(shí)，SPAG9 在促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中作為一種支架蛋白與JNK相互作用，通過調(diào)節(jié)與之相關(guān)的MAPKs組件的信號強(qiáng)度發(fā)揮作用[5]，參與人體多種生理作用的調(diào)控，并且在細(xì)胞生長、增殖、凋亡和腫瘤發(fā)展中有重要作用。Kanojia[13]在結(jié)腸癌細(xì)胞株（COLO 205、HCT 116）和結(jié)腸癌組織中檢測到SPAG9 mRNA和蛋白表達(dá)，且70.4%結(jié)腸癌患者血清中出現(xiàn)了SPAG9 的特異性抗體，推測其可能通過MAPK信號通路在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPAG9 在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌標(biāo)本中高表達(dá)，在正常結(jié)直腸及癌旁組織中均不表達(dá)；在早期結(jié)直腸癌表達(dá)為I+Ⅱ(92.7%)、進(jìn)展期結(jié)直腸癌為Ⅲ+Ⅳ(64.3%)，P＜0.05。筆者的數(shù)據(jù)顯示，SPAG9 表達(dá)水平在臨床期別的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于癌細(xì)胞的侵襲性取決于腫瘤不斷遷徙與侵襲特性，Kanojia[10]通過SPAG 9 SiRNA轉(zhuǎn)染后減少了SPAG9 蛋白表達(dá)，致結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降和改變，減少SPAG9 蛋白在體內(nèi)的表達(dá)可以明顯延緩腫瘤的生長，從而證實(shí)了SPAG9 在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中的潛在作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SPAG9 在腫瘤的臨床早期階段（Ⅰ和Ⅱ期）表達(dá)的密切關(guān)系，表明SPAG9 可能在細(xì)胞生長、增殖、細(xì)胞遷移、浸潤中扮演一個(gè)重要的作用。

其他學(xué)者在研究SPAG9 與腫瘤的生物學(xué)行為同樣發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)于體外下調(diào)宮頸癌[3]、甲狀腺癌[10]、腎細(xì)胞癌[2]等細(xì)胞的SPAG9 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞生長受抑制，細(xì)胞遷移和侵襲能力下降，其中甲狀腺癌、腎癌細(xì)胞的克隆形成能力也下降；此外，用裸鼠進(jìn)行移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SPAG9 基因干擾后，結(jié)腸癌、宮頸癌的腫瘤細(xì)胞生長受到明顯抑制[3，10]。雖然上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SPAG9 與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，但其機(jī)制尚不清楚。氨基酸序列分析揭示了SPAG9 蛋白包含JBD，研究發(fā)現(xiàn)，若將SPAG9 的可讀框第111～934 bp區(qū)域突變，使其缺乏JBD，它就不能參與JNK通路而發(fā)揮作用，這表明SPAG9 是通過JBD與JNK相互作用[14]。JNK家族是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成員之一，屬于進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[15]，JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路的一個(gè)重要分支，在細(xì)胞周期、分化、凋亡、應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用。近年來在JNK信號通路中發(fā)現(xiàn)多種潛在的支架蛋白，如JNK連接蛋白JIP、JNK相關(guān)亮氨酸拉鏈蛋白JLP等[16]，這些支架蛋白與JNK及MAPK信號通路中的其他成員相結(jié)合形成復(fù)合物，從而對信號通路的效率及特異性起重要調(diào)節(jié)作用[15]。研究證實(shí)，SPAG9 在MAPK信號通路中可能是作為一種支架蛋白通過與JNK的相互作用，參與人體多種生理功能的調(diào)控，并與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[17]。然而，作為JIP家族的新成員，SPAG9 蛋白如何精細(xì)調(diào)節(jié)這些信號通路及為何在結(jié)直腸癌早期表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

目前，在許多腫瘤組織中都可檢測到SPAG9 蛋白，該蛋白在乳腺癌[5]、宮頸癌[3]、甲狀腺癌[5]和肺癌[18]組織中的表達(dá)率分別為88%（88/100）、82%（54/66）、78%（108/138）和77.78%（21/27）。研究者發(fā)現(xiàn)90%（18/20）的上皮卵巢癌組織[19]中也有SPAG9 蛋白表達(dá)，且早期上皮性卵巢癌SPAG9 mRNA的表達(dá)率較高。本研究同樣驗(yàn)證了SPAG9 蛋白的高表達(dá)與CRC發(fā)展的早期和晚期階段有顯著密切的關(guān)系（P＜0.003）。由于SPAG9 的潛在作用，作為一種新型的生物標(biāo)志物，有利于癌癥的早期檢測和診斷。

研究已經(jīng)證實(shí)SPAG9 蛋白在許多腫瘤患者中如卵巢癌[19]、腎癌[2]、乳腺癌[5]、宮頸癌[3]可以激發(fā)機(jī)體體液免疫反應(yīng)，并在患者血清中檢測到特異性抗體，而針對腫瘤免疫原的抗體進(jìn)入血液循環(huán)早于抗原，且抗體的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗原，所以檢測血清中的特異性抗體相對血清抗原而言是具有其獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其是在腫瘤的早期，更易被檢測，所以SPAG9 蛋白及其血清抗體是更有前景和應(yīng)用價(jià)值的腫瘤組織學(xué)和血清學(xué)標(biāo)志物。

近年來，針對SPAG9 蛋白的腫瘤疫苗也備受學(xué)者關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPAG9 在結(jié)直腸腺瘤及結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且與臨床早期密切相關(guān)，可以作為結(jié)直腸癌的早期檢測和診斷，阻斷SPAG9 表達(dá)可能為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的選擇。

[1]Sungjj,Laujy,Gohkl,et al.Increasing incidence of colorectal cancer in Asia: implications for screening[J].Lancet Oncol,2005,6(11):871-876.

[2]Garg M,Kanojia D,Khosla A,et a 1.Sperm-associated antigen 9 is associated with tumor growth,migration,and invasion in renal cell carcinoma[J].Cancer Res,2008,68(20):8240-8248.

[3]Garg M,Kanojia D,Salhan S,et a 1.Sperm-associated antigen 9 is a biomarker for early cervical carcinoma[J].Cancer,2009,l 15（21）:2671-2683.

[4]Peng Yu,Lei Yan,Hui Zhang,et al.Expression and clinical significance of sperm-associated antigen 9 in patients with endometrial carcinoma[J].Internat J Gynecol Cancer,2012,22（1）:l 87-193.

[5]Garg M,Kanojia D,Suri S,et al.Sperm-associated antigen 9:a novel diagnostic marker for thyroid cancer[J].J Clin Endocrinol Metab,2009,94:4613-4618.

[6]Jagadish N,Rana R.Characterization of a novel human sperm-associated antigen 9(SPAG 9)having structural homology with c-Jun N-terminal kinase-interacting protein[J].Biochem J,2005,389(Sup 1):73-82.

[7]Shankar S,Mohapatra B,Suri A.Cloning of a novel human testis mRNA specifically expressed in testicular haploid germ cells,having unique palindromic sequences and encoding a leucine zipper dimerization motif[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,243（2）:561-565.

[8]Qi M,Elion EA.MAP kinase pathways[J].J Cell Sci，2005，118(16):3569-3572.

[9]Kim M，Murakami A，Kawabata K，et al.Epigallocatechin-3-gallate promotes pro-matrix metalloproteinase-7 production via activation of the JNK 1/2 pathway in HT-29 human colorectal cancer cells[J].Carcino genesis,2005,26(9):1553-1562.

[10]Collins CS,Hong J,Sapinoso L,et a 1.A small interfering RNA screen for modulators of tumor cell motility identinesMAP4 K 4 as a pro-migratory kinase[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(10):3775-3780.

[11]Zendman AJ,Ruiter DJ,Van Muijen GN.Cancer/testis一associated genes：identification,expression profile,and putative function[J].J Cell Physiol,2003,194(3):272-288.

[12]Simpson AJ,Caballero OL,Jungbluth A,et al.Cancer/testisantigens,gameto genesisandeancer[J].NatRevCaneer,2005,5:615-625.

[13]Kanojia D.Sperm-associated antigen 9 is a novel biomarker for colorectal cancer and is involved in tumor growth and tumorigenicity[J].Am J Pathol,2011,178:1009-1020

[14]Jagadish N.Characterization of a novel human sperm-associated antigen 9 (SPAG 9) having structural homology with c-Jun N-terminal kinaseinteracting protein[J].Biochem J,2005,389:73-82.

[15]姚毓奇，李曉玫.JNK信號通路研究進(jìn)展[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2005，27（3）：242-246.

[16]Xu Z.POSH acts as a scaffold for a multiprotein complex that mediates JNK activation in apoptosis[J].EMBO J,2003,22:252-261.

[17]陳杰，王昌，徐忠華.精子相關(guān)抗原SPAG9 與腫瘤[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2011，38（6）：421-423.

[18]宋慶軍，崔國興，鄭金旭，等.SPAG9 在肺癌中的表達(dá)[J].中國醫(yī)藥指南，2009，7（10）：52-55.

[19]Garg M.Sperm-associated antigen 9,a novel cancer testis antigen,is a potential target for immunotherapy in epithelial ovarian cancer[J].Clin Cancer Res,2007,13:1421-1428.