食品中傷寒沙門氏菌TaqMan探針實時PCR檢測方法

曹冬梅 袁慕云 史媛媛 劉 洋 許龍巖 曹際娟*

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局 遼寧大連 116001；2.廣東出入境檢驗檢疫局）

1 前言

沙門氏菌（Salmonella）是人類重要的腸道致病菌，也可在動物腸道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙門氏菌有2500多個血清型，在中國發(fā)現(xiàn)了200多個血清型。沙門氏菌所致疾病中最常見的一類是急性胃腸炎，可由不同菌型引起，以鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）、腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）、湯卜遜沙門氏菌（Salmonalla thompson）等最為常見；另一類重要疾病是傷寒和副傷寒（統(tǒng)稱腸熱癥），它們是一種獨特的急性全身性發(fā)熱性單核細胞內(nèi)感染，由傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhi）及甲型、乙型和丙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi）等引起，其中傷寒沙門菌是最常見的引發(fā)傷寒疾病的血清型，與食物中毒有直接關(guān)系；此外，還有敗血癥，由豬霍亂沙門氏菌（Salmonella Choleraesuis）等引起。

本研究小組已經(jīng)建立了針對鼠傷寒沙門氏菌[1,2]、腸炎沙門氏菌[3]、副傷寒沙門氏菌[4]、豬霍亂沙門氏菌[4]、雞傷寒沙門氏菌[5]等基于TaqMan探針實時PCR和焦磷酸測序技術(shù)的快速檢測方法，可以實現(xiàn)快速鑒定。鑒于目前傷寒沙門氏菌鑒定主要是依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，即選擇性增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型，通常要5-6天才能得出檢測結(jié)果，不利于及時診斷、查找病源，控制病情的蔓延。因此，本研究針對傷寒沙門氏菌設(shè)計特異性檢測的引物和TaqMan探針，并以雞肉、魚肉、豬肉為模擬樣品，開展實時PCR檢測方法的研究，以期快速、準(zhǔn)確鑒定傷寒沙門氏菌。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗菌株

不同血清型的沙門氏菌共60株，其中1株傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，30株傷寒沙門氏菌分離株，27株其他血清型沙門氏菌，7株大腸埃希氏菌等非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（具體菌株信息見表1）。上述菌株均采用API 20E 試劑條和血清學(xué)試驗進行確證。

表1 菌株信息表

（續(xù)表）

2.1.2 主要試劑

TTB增菌液、BP緩沖蛋白胨水：北京陸橋技術(shù)有限公司；PCR用緩沖液、Taq DNA聚合酶、ROX、dNTP：寶生物工程（大連）有限公司。

2.1.3 主要儀器

實時熒光PCR：ABI 7500，美國；核酸提取儀：E7001，日本PPS公司。

2.2 方法

2.2.1 引物探針的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的傷寒沙門氏菌基因序列，采用Oligo6.0軟件設(shè)計引物和Taqman探針，特異性擴增傷寒沙門氏菌。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列見表2。

表2 引物和探針信息表

2.2.2 DNA提取和特異性試驗

所有沙門氏菌菌株采用BP緩沖蛋白胨水37℃培養(yǎng)10h，取10mL接種于TTB增菌液，44.5℃培養(yǎng)18h，取1mL菌懸液移入離心管，12000 r/min離心5min去上清，用1mL去離子水漂浮沉淀，12000 r/min離心3min去上清，重復(fù)兩次，最后加200μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA，用于實時熒光PCR擴增。非沙門氏菌陰性對照菌株用相應(yīng)的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取1mL菌懸液移入離心管，按上述步驟提取DNA用于實時熒光PCR擴增。所有菌株的DNA用于傷寒沙門氏菌的特異性實驗。

2.2.3 實時熒光PCR反應(yīng)體系和參數(shù)

實時熒光PCR反應(yīng)體系為30μL，其中模板DNA1μL、10 ×TaqMan緩沖液4μL、5mmol/LMgCl22μL、2.5mmol/L dNTPs 3μL、TaqMan探針20μmol/l1μL、正向和反向引物20μmol/l各1μL（共2μL）、UNG酶(0.55U)0.2μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)3μL、去離子水13.8μL。實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃30s，95℃5s，60℃34s，40個循環(huán)。

實時熒光PCR擴增曲線指數(shù)期明顯、Ct<37為陽性判定原則。其中以Ct<35 且擴增曲線指數(shù)期明顯可直接判定為陽性；Ct值在35-37之間判斷為可疑，需要加大模板量進行重復(fù)實驗，如出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴增曲線方可判定為陽性，否則為陰性。

2.2.4 模擬樣品檢測和靈敏度試驗

取雞肉、魚肉、豬肉樣品，采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》GB4789.4-2010進行培養(yǎng)鑒定，確認(rèn)無沙門氏菌污染。然后分別秤取25g 雞肉、魚肉、豬肉，每份樣品中分別添加不同濃度的傷寒沙門氏菌菌懸液（以未添加菌液的樣品作為陰性對照），制成12份模擬樣品。在每份樣品中加入225mL緩沖蛋白胨水，用拍打器拍打2min，37℃ 培養(yǎng)10h，取10mL移入90mL TTB增菌液，44.5℃培養(yǎng)18h，然后取增菌液提取DNA用于實時熒光PCR擴增。同時，不同濃度的模擬污染樣品也用于實時PCR方法的檢測靈敏性試驗。所有模擬樣品按照GB4789.4-2010與實時熒光PCR方法同步進行培養(yǎng)鑒定。

3 結(jié)果

3.1 特異性試驗結(jié)果

取表1中所列的1株傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、30株傷寒沙門氏菌分離株、27株其他血清型沙門氏菌以及7株大腸埃希氏菌等非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA，采用表2中的檢測引物和探針進行實時熒光PCR檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 傷寒沙門氏菌特異性試驗的實時熒光PCR擴增圖譜

圖1顯示，31株傷寒沙門氏菌的DNA樣本經(jīng)過實時熒光PCR擴增，均檢出陽性增幅曲線；27株其他血清型沙門氏菌、7株非沙門氏菌的DNA樣本的檢測結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明所設(shè)計的傷寒沙門氏菌檢測引物和探針具有很好的特異性。

以傷寒沙門氏菌（CMCC 50071）菌株的系列稀釋DNA為模板進行實時熒光PCR擴增，結(jié)果（見表3）顯示，傷寒沙門氏菌菌株的模板濃度與Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)（R2）為0.994，擴增效率為94.5%。

表3 實時熒光PCR擴增效率

3.2 模擬樣品檢測和靈敏度試驗結(jié)果

12份按不同濃度添加的模擬污染樣品，經(jīng)實時熒光PCR檢測，均擴增出與預(yù)期相符的傷寒沙門氏菌陽性增幅曲線，檢測結(jié)果的Ct值見表4。同時，按照GB4789.4-2010 檢測模擬污染樣品，均分離鑒定出傷寒沙門氏菌，檢測結(jié)果與實時熒光PCR結(jié)果相同。

表4 模擬污染傷寒沙門氏菌樣品的實時熒光PCR檢測結(jié)果

從表4不同添加菌液濃度的靈敏度試驗結(jié)果可見，傷寒沙門氏菌模擬污染樣品的實時PCR檢測靈敏度可以達到4cfu/mL的添加濃度。

4 討論

沙門氏菌的傳統(tǒng)方法鑒定需要經(jīng)過病原的初步分離、生化鑒定并結(jié)合血清學(xué)分型，因此存在一定比例的假陽性等問題[6-8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有針對invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEFl4、sefA、sdf、ssaQ、fimY[9-18]等為目標(biāo)基因，用普通PCR或?qū)崟r熒光PCR檢測沙門氏菌的報道，但以上述方法只能檢測沙門氏菌的毒力基因，不能確定血清型。杜邦公司的Bax系統(tǒng)利用熒光PCR技術(shù)從種的水平上檢測沙門氏菌，具有較高的特異性，但同樣不能確定血清型。Camila等[19]針對ompC、SdfI、ViaB、Spy為目的基因設(shè)計引物，建立了多重PCR檢測沙門氏菌及其主要血清型（腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌）的方法，應(yīng)用于雞肉中的沙門氏菌檢測；KIM[20]等也根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的特異序列設(shè)計多對引物，建立了多重PCR檢測方法，均得到較好的效果。但上述方法需通過凝膠電泳判定結(jié)果，操作較為繁瑣。Edel等[21]用flic、sefA、sdf、acek基因設(shè)計引物探針，用多重?zé)晒釶CR方法檢測腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等；David[22]等用普通PCR和熒光PCR檢測豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌。從上述可見，有關(guān)開展分子生物學(xué)快速檢測傷寒沙門氏菌的報道很少。

5 結(jié)論

本研究建立的TaqMan探針實時PCR檢測食品中傷寒沙門氏菌的方法具有很好的特異性、快捷性，模板濃度與Ct值有良好的線性關(guān)系，熒光PCR擴增效率高，線性系數(shù)（R2）為0.994，檢測靈敏度均可達到4cfu/mL的添加濃度；經(jīng)模擬樣品驗證，所建立的實時PCR方法與傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果相一致。本方法具有檢測周期短，操作簡便的優(yōu)勢，可以快速鑒定傷寒沙門氏菌，在快速診斷病原、控制病情等方面具有很好的應(yīng)用前景。

［1］曹冬梅，徐楊，袁慕云，等.焦磷酸測序檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌[J].微生物學(xué)雜志，2013，33（6）：101-105.

［2］榮策，趙彤彤，劉宇，等.實時熒光PCR檢測鼠傷寒沙門氏菌[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2012，3(8):300-305.

［3］榮策，孫銘英，那晗，等.建立Taqman探針實時熒光PCR檢測食品中腸炎沙門氏菌的方法[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2012，9：7-11.

［4］鄭秋月，趙彤彤，袁慕云，等.實時熒光PCR檢測食品中丙型副傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌[J].食品科技，2014，39（2）：297-301.

［5］劉冉，趙玉琢，孫銘英，等.建立實時熒光PCR快速鑒定雞制品中雞傷寒沙門氏菌的方法[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報，2014，37（2）：252-257.

［6］ZAMORA B M,HARTUNG M,HILDEBRANDT G,et a1.Detection of antibodies to S.enteritidis in broilers by means of indirect ELISA and Chemiluminescent Immunoassay(CLlA)[J].Zentralbl Veterinarmed B,1999,46(1):9-23.

［7］HOSlE B D,GRANT D A.Salmonella enteritidis infection in pheasant chicks and poults[J].Vet Rec,1990,126(2):39-40.

［8］COOPER G L,NICHOLAS R A,BRACEWELLC D.Serological and bacteriological investigations of chickens from flocks naturally infected with SalmoneUa enteritidis[J].Vet Rec,1989,125(23):567-572.

［9］[9]Rahn K,S A De Grandis,R C Clarke,et al.Amplification of an invA gene sequence of salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of salmonella[J].Mol Cell Probes,1992,6:271-279.

［10］Kwang J,Littledike E T,Keen J E.Use of the polymerase chain reaction for Salmonella detection[J].Lett Appl Microbiol,1996,22:46-51.

［11］Chiu C H,Jonathan T.Rapid identification of Salmonella Serovars in Feces by specific detection of virulence genes,invA and spvC,by an enrichment broth culture multiplex PCR combination assay[J].Journal of Clinical Microbiology,1996,34( 10) :2619-2622.

［12］Thomson N R,Clayton D J,Windhorst D,et al.Comparative genome analysis of Salmonella Enteritidis PT4 and Salmonella Gallinarum 287/91 provides insights into evolutionary and host adaptation pathways[J].Genome Res,2008,18( 10) :1624-1637.

［13］Doran J L,Collinson S K,Burian J,et a1.DNA-based diagnostic tests for Salmonella species targeting agfA the structural gene for thin,aggregative fimbriae[J].J Clin Microbial,1993,31：2263-2273.

［14］Turcotte C,Woodward M J.Cloning,DNA nucleotide sequence and distribution of the gene encoding the SEFl4 fimbrial antigen of Salmonella enteritidis[J].J Geg Microbiol,1993,139：1477-1485.

［15］Deng S,Cheng A,Wang M.Salmonella enteritidis strain-specific PCR and rapid detection of infected ducks[J].Chin J Veter Sci,2009,29(2),153-157.

［16］Dan X,Liu B,Li X,et al.The establishment and evaluation of fluorescence quantitative PCR detection system for Salmonella with added internal standard[J].Acta Microbiol Sin,2011,51:1119-1127.

［17］Wang Z,Ji S,Yang Y,et al.The establishment of dual fluorescence quantitative PCR detection method for Salmonella and Listeria monocytogenes[J].Chin J Food Hyg,2011,23:289-292.

［18］Xuan Guo,Jinru Chen,Larry R,et al.PCR Dectection of salmonella enterica serotype Montevideo in and on Raw Tomatoes Using Primes Derived from hilA[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(12):5248-5252.

［19］Camila Guimar?es de Freitas，?ngela Patrícia Santana，Patrícia Helena Caldeira da Silva,et al.PCR multiplex for detection of Salmonella Enteritidis,Typhi and Typhimurium and occurrence in poultry meat[J].Int J Food Microbiol,2010,139:15-22.

［20］Kim S,Frye J G,Hu J,et al.Multiplex PCR-based method for identification of common clinical serotypes of Salmonella enteric subsp.enterica[J].J Clin Microbiol,2006,44(10) :3608-3615.

［21］Edel O’Regan,Evonne McCabe,Catherine Burgess,et all.Development of a real-time multiplex PCR assay for the detection of multiple Salmonella serotypes in chicken samples[J].BMC Microbiology,2008,8:1471-2108.

［22］David F Woods,F Jerry Reen,Deirdre Gilroy,et al.Rapid Multiplex PCR and Real-Time TaqMan PCR Assays for Detection of Salmonella enterica and the Highly Virulent Serovars Choleraesuis and Paratyphi C[J].Journal Of Clinical Microbiology,2008,46(12):4018-4022.