乙型肝炎肝硬化患者外周血樹突狀細(xì)胞亞群的鑒定及其臨床意義

鄭盛，唐映梅，楊晉輝

乙型肝炎肝硬化患者外周血樹突狀細(xì)胞亞群的鑒定及其臨床意義

鄭盛，唐映梅，楊晉輝

目的探討檢測乙型肝炎肝硬化患者外周血樹突狀細(xì)胞（DC）亞群的臨床意義。方法采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測42例乙型肝炎肝硬化患者、45例慢性乙型肝炎患者和30例健康人外周血DC細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞亞群的構(gòu)成，比較三者間的差異。結(jié)果乙型肝炎肝硬化患者外周血DC1和DC2百分?jǐn)?shù)分別為（0.2±0.1）%和（0.2±0.04）%，慢性乙型肝炎患者為（0.3±0.1）%和（0.2±0.1）%，均顯著低于健康人群[（0.4±0.1）%和（0.3±0.1）%，P＜0.01]；13例HBeAg陽性乙型肝炎肝硬化患者外周血DC2亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)為（5.62±1.28）個(gè)/μL，顯著低于29例HBeAg陰性的乙型肝炎肝硬化患者[（8.75±2.32）個(gè)/μL，P＜0.05]，但是兩者DC1細(xì)胞水平無明顯差別；乙型肝炎肝硬化患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（588.4±124.2）個(gè)/μL和（338.5±97.4）個(gè)/μL，均顯著低于慢性乙型肝炎患者[（686.7±106.5）個(gè)/μL和（432.1±102.6）個(gè)/μL，P＜0.05]，而且乙型肝炎肝硬化患者和慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞數(shù)均顯著低于健康對照人群[（560.2±105.6）個(gè)/μL，P＜0.05]。結(jié)論乙型肝炎肝硬化患者外周血DC1和DC2數(shù)量減少，伴CD8+T細(xì)胞數(shù)降低，可能是導(dǎo)致肝硬化形成的原因之一。

肝硬化；慢性乙型肝炎；樹突狀細(xì)胞；外周血

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2012年5月至2013年10月我院門診或住院的乙型肝炎肝硬化患者42例，男性31例，女性11例；年齡37～66歲，平均年齡（47.4±5.6）歲。其中HBeAg陽性13例，HBeAg陰性29例。慢性乙型肝炎患者45例，男性31例，女性11例；年齡26～47歲，平均（34.6±6.8）歲。其中輕、中度35例，重度10例。診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[5]。排除其他肝炎病毒感染。另選健康體檢人群30例，男性18例，女性12例；年齡18～66歲，平均年齡（40.5±6.6）歲，均無肝炎病史，乙型肝炎病毒標(biāo)志物陰性，肝功能正常。

1.2 外周血DC亞群和淋巴細(xì)胞亞群檢測使用FACS caliber流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測。采集肝素抗凝外周血3 ml，在采集后4 h之內(nèi)檢測。淋巴細(xì)胞分離液（1.077 g/ml，美國Sigma公司）；溶血素、鞘液、空白對照、Lineage Cocktail （CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56-FITC）、三色熒光標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體CD123（IL-3Ra）PE、CD11cPE、HLA-DR PerCP以及檢測淋巴細(xì)胞亞群的Simultest IMK-lymphocyte試劑盒均購自美國BD公司。淋巴細(xì)胞亞群的檢測主要包括T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）、NK細(xì)胞（CD16+）和B細(xì)胞（CD19+）。DC亞群檢測方法如下：共設(shè)置4支試管，每管加抗體組合為Tube1（Lin1-FITC，CD123-PE，anti-HLA-DR-PerCP）；Tube 2（Lin1-FITC，mouse IgG1-PE，anti-HLA-DR-PerCP）；Tube 3（Lin1-FITC，CD11c-PE，anti-HLA-DR-Per－CP）；Tube 4（Lin1-FITC，mouse IgG2a-PE，anti-HLADR-PerCP）。先將所需抗體加入流式管中，每管加入100 μl新鮮抗凝血，混勻，15min后加溶血素，室溫避光放置10 min，離心，用PBS洗滌細(xì)胞1次，然后加入400 ml PBS重懸細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測。采用SimlSET軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件，所有檢測數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，各組DC1及DC2的百分比也以（±s）表示，采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人群外周血DC細(xì)胞亞群比較根據(jù)DC亞群的表面分子表達(dá)特性，我們利用流式細(xì)胞儀通過三色分析法先將Lin1-、anti-HLA-DR+細(xì)胞圈出。在此基礎(chǔ)上再分出CD123+++細(xì)胞，即為DC2細(xì)胞亞群，而CD11c+++細(xì)胞就是DC1細(xì)胞亞群。經(jīng)過對患者和健康人血檢測證實(shí)，該方法操作簡便，可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)各細(xì)胞亞群。各組人群外周血DC細(xì)胞亞群比較見表1。

表1 各組人群DC1和DC2細(xì)胞計(jì)數(shù)（%）比較

2.2 乙型肝炎肝硬化患者外周T淋巴細(xì)胞亞群的變化用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞的比例，結(jié)果見表2。HBeAg陽性與陰性乙型肝炎肝硬化患者外周血CD4+細(xì)胞無顯著性差異[（559.7±117.7）個(gè)/μl對（565.1±124.5）個(gè)/μl]，而HBeAg陽性患者CD8+T細(xì)胞較HBeAg陰性患者明顯降低[221.2±66.3）個(gè)/μl對（321.3±106.5）個(gè)/μl]，CD4+/CD8+比值明顯增高（資料未列出），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組人群外周血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)（±s）比較

表2 各組人群外周血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)（±s）比較

與健康人和慢性乙型肝炎患者比，①P＜0.05；與健康人比，②P＜0.05

例數(shù)CD4+（個(gè)/μl）CD8+（個(gè)/μl）CD4+/CD8+健康人30699.1±153.5560.2±105.61.3±0.1慢性乙型肝炎45686.7±106.5432.1±102.6②1.6±0.2②乙型肝炎肝硬化42588.4±124.2①338.5±97.4①1.8±0.3①

2.3 HBeAg陽性與陰性乙型肝炎肝硬化患者外周血DC亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)比較見表3。

表3 HBeAg陽性與陰性肝硬化患者DC亞群（個(gè)/μL，±s）的比較

表3 HBeAg陽性與陰性肝硬化患者DC亞群（個(gè)/μL，±s）的比較

①P＜0.05

例數(shù)DC1絕對計(jì)數(shù)DC2絕對計(jì)數(shù)HBeAg陽性138.74±2.015.62±1.28 HBeAg陰性299.32±2.138.75±2.32①

3 討論

DC是具有最強(qiáng)提呈抗原功能的專職抗原提呈細(xì)胞（APC），其在體內(nèi)的數(shù)量較少，僅占人外周血單個(gè)核細(xì)胞的1%以下，但抗原提呈能力遠(yuǎn)強(qiáng)于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等其他APC，是啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，具有激發(fā)CD4+Th細(xì)胞和CD8+CTL的能力，在抗病毒的細(xì)胞免疫治療中起重要的作用。成熟的DC能分泌IL-12等各類細(xì)胞因子，能使細(xì)胞CD80和CD86等共刺激分子表達(dá)增加，增強(qiáng)體外激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）的能力，有效激活靜息T細(xì)胞發(fā)生初次免疫應(yīng)答，并與輔助性T細(xì)胞相互作用，參與免疫調(diào)節(jié)，刺激T細(xì)胞增殖，致敏CTL和NK細(xì)胞。

慢性乙型病毒性肝炎的發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚，其可發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌，后果特別嚴(yán)重，慢性乙型病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展與特異性免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子的表達(dá)密切相關(guān)，這其中細(xì)胞的免疫耐受可能起主要作用，造成慢性乙型病毒性肝炎患者免疫耐受的重要原因之一是患者DC功能低下，抗原提呈功能缺陷，不能有效地把病毒抗原傳遞給機(jī)體免疫系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者體內(nèi)存在DC數(shù)量和功能下降[6～10]。本文采用流式細(xì)胞技術(shù)初步觀察了乙型肝炎肝硬化患者外周血DC1和DC2變化，發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化和慢性乙型肝炎患者外周血DC1和DC2細(xì)胞百分比和絕對數(shù)均顯著低于正常人，支持Ma et al[11]的研究結(jié)果，特別是乙型肝炎肝硬化患者外周血DC2細(xì)胞絕對數(shù)較健康人和慢性乙型肝炎患者降低顯著。DC2被認(rèn)為是體內(nèi)外周血中專職產(chǎn)生IFN-α的細(xì)胞，它產(chǎn)生IFN-α的能力是其他細(xì)胞的200～1000倍。研究發(fā)現(xiàn)，AIDS患者外周血DC2細(xì)胞數(shù)量和功能明顯降低，且DC2細(xì)胞數(shù)量與產(chǎn)生IFN的水平呈正相關(guān)，而與HIV載量呈負(fù)相關(guān)，表明DC2在清除病毒方面可能起著重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者體內(nèi)DC1和DC2數(shù)量明顯下降，可能是導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低的原因。

淋巴細(xì)胞亞群可反映機(jī)體基本免疫狀態(tài)，其平衡直接影響HBV感染的轉(zhuǎn)歸，不僅有效應(yīng)功能，也是免疫調(diào)節(jié)的主要介導(dǎo)者[13]。HBV的清除主要靠自身毒性T淋巴細(xì)胞及其激活的非特異性炎癥和它們釋放的炎性因子。宿主的細(xì)胞免疫功能特別是HBV特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)和CD8+T反應(yīng)對HBV的清除和疾病的轉(zhuǎn)歸有重要的影響[14]。不同個(gè)體在HBV感染后的免疫學(xué)和臨床轉(zhuǎn)歸不同，這與宿主的人類白細(xì)胞抗原（Human leukocyte antigens，HLA）等遺傳學(xué)背景、HBV自身特性和細(xì)胞免疫應(yīng)答均相關(guān)[15]。在慢性乙型病毒性肝炎患者，HLA-1限制性的針對HBV各類抗原表位的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）應(yīng)答常常不足或十分微弱，是肝細(xì)胞內(nèi)HBV不易清除，病情遷延不愈的重要機(jī)制之一[16]。而近年來的研究證實(shí)Treg細(xì)胞具有免疫無能性和免疫抑制性，在低濃度IL-2刺激下不反應(yīng)，但在高濃度IL-2條件下經(jīng)TCR激活后可活化或增殖，抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞IL-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而干擾其活化與增殖，而且對CD8+細(xì)胞的殺傷功能有明顯抑制[17]。HBV在體內(nèi)的清除、復(fù)制與機(jī)體的免疫功能有關(guān)，而細(xì)胞免疫反應(yīng)又起了關(guān)鍵的作用，其中T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用對肝細(xì)胞的損傷和HBV的清除尤為重要。近年來的研究表明[18]，T淋巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號，即T細(xì)胞的活化不僅需要T細(xì)胞受體識別主要組織相容性復(fù)合物分子（第一信號），還需要抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面的共刺激分子與其受體結(jié)合（第二信號）的共同作用，由T細(xì)胞上的共刺激分子與APC表面的配體結(jié)合所誘導(dǎo)，啟動維持并調(diào)節(jié)活化級聯(lián)反應(yīng)，決定了T細(xì)胞是活化增殖，或者轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡。

目前，有關(guān)慢性乙型病毒性肝炎患者細(xì)胞免疫狀態(tài)的報(bào)道很多，其中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞對病毒抗原的反應(yīng)是HBV感染過程中引起肝細(xì)胞損害的重要機(jī)制，HBV特異性的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)與病毒清除有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)在慢性乙型病毒性肝炎患者中CD8+CD28+T細(xì)胞明顯降低，可能與HBV持續(xù)存在、病情遷延不愈有關(guān)，CD8+CD28+T細(xì)胞清除病毒的同時(shí)，也可引起肝細(xì)胞的破壞和凋亡，造成肝功能的損害。有報(bào)道[19]認(rèn)為，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)均明顯低于正常人，尤其是Th1類細(xì)胞因子下降可能導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降，感染乙型肝炎病毒后病毒不易被清除。本組乙型肝炎肝硬化患者CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)均有下降，尤以CD8+T下降更為明顯，CD4+T/CD8+T比值升高，推測可能與患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞大量被消耗，機(jī)體清除病毒能力下降有關(guān)。在HBeAg陽性乙型肝炎肝硬化患者CD8+T細(xì)胞數(shù)和DC2數(shù)量均明顯低于HBeAg陰性患者，這也是導(dǎo)致疾病進(jìn)展和遷延的原因之一[20]。乙型肝炎肝硬化患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群較健康人和慢性乙型肝炎患者均有所降低，特別是CD8+T細(xì)胞下降更為顯著，CD4+T/CD8+T比值升高，推測在乙型肝炎肝硬化患者體內(nèi)存在著輔助性T細(xì)胞功能減弱，細(xì)胞毒T細(xì)胞功能亢進(jìn)，與肝臟的炎癥與壞死程度一致，持續(xù)免疫清除導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷并進(jìn)展至肝硬化。

因此，恢復(fù)慢性乙型病毒性肝炎患者DC的功能，提高T淋巴細(xì)胞的抗原提呈能力，對啟動機(jī)體免疫應(yīng)答，糾正HBV感染中的免疫功能缺陷或低下十分有利，有助于體內(nèi)HBV的清除。

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（收稿：2013-09-26）

（校對：陳從新）

Clinical implication of peripheral blood dendritic cell subsets in cirrhotic patients with hepatitis B virus infection

Zheng Sheng，Tang Yingmei，Yang Jinhui.Department of Gastroenterology，Third People’s Hospital，Yunnan Province，Kunming 650011，China

Objective To evaluate the clinical implication of peripheral blood dendritic cell（DC）subsets in cirrhotic patients with hepatitis B virus（HBV）infection.Methods Flow cytometry was used to analyze the counts of peripheral blood DC subsets and T lymphocyte subsets in 42 cirrhotic patients with HBV infection，45 patients with chronic hepatitis B and 30 healthy persons.Results The percentages of DC1 and DC2 subsets were（0.2±0.1）%and（0.2±0.04）%，respectively，in cirrhotic patients with chronic HBV infection，and（0.3±0.1）%and（0.2±0.1）%，respectively，in patients with chronic hepatitis B，all weresignificantly lower than those in health controls[（0.4±0.1）%and（0.3±0.1）%，P＜0.01]；The DC2 subset in 13 cirrhotic patients with HBeAg-positive was（5.62±1.28）cells per microliter，significantly lower than that in 29 cirrhotic patients with HBeAg-negtive[（8.75± 2.32）cells per microliter，P<0.05]；No significant difference was found in DC1 subsets between cirrhotic patients with HBeAg-positive and HBeAg-negative；The CD4+T lymphocyte and CD8+T lymphocyte counts in cirrhotic patients were（588.4±124.2）cells per microliter and（338.5±97.4）cells per microliter，both significantly lower than those in patients with chronic hepatitis B[（686.7±106.5）cells per microliter and（432.1±102.6）cells per microliter，P＜0.05]；Moreover，CD8+T lymphocytes in patients with cirrhosis and with chronic hepatitis B were both significantly lower than that in health controls[（560.2±105.6）cells per microliter，P＜0.05].Conclusion The decrease in DC1 and DC2 subsets in cirrhotic patients with HBV infection，accompanied with a decrease in CD8+T lymphocytes，might play an important role in the development of cirrhosis after HBV infection.

Cirrhosis；Hepatitis B；Dendritic cell；Peripheral blood樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）在人體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要的作用[1]，它是一種最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，可以將進(jìn)入人體的外來抗原提呈給激活的淋巴細(xì)胞，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對外來抗原的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)。DC在外周血中的含量甚少，目前的研究發(fā)現(xiàn)[2]，根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志的不同，可以將DC分為2個(gè)亞群，即DC1和DC2。DC1特征性表面標(biāo)志是Lin1-CD4+HLA-DR+CD11chighCD123low，它是來源于髓系的樹突狀細(xì)胞（mDC）。DC2的特征性表面標(biāo)志是Lin1-CD4+HLA-DR+CD11c-CD123high，又稱為類漿型樹突狀細(xì)胞（pDC）。此外，也有研究[3]把pDC稱作干擾素產(chǎn)生細(xì)胞（interferon producing cell，IPC）。DC1的主要功能是發(fā)揮抗原遞呈作用，而DC2則是體內(nèi)專職產(chǎn)生干擾素的細(xì)胞，且以產(chǎn)生Ⅰ型干擾素α為主。目前，國內(nèi)有關(guān)樹突狀細(xì)胞不同亞群變化及與疾病關(guān)系的研究報(bào)道尚少[4]。為此，我們對乙型肝炎肝硬化患者外周血DC亞群和T淋巴細(xì)胞亞群的變化及其與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了分析。

650011 昆明市云南省第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科（鄭盛）；昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病中心（唐映梅，楊晉輝）

鄭盛，男，31歲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。從事各種急慢性肝病的基礎(chǔ)及臨床研究。E-mail: zheng_sheng523@163.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.014