740例HBV感染者血清HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥位點分析*

戴明佳，方圓，汪莉萍，武桂萍，石銀月，顏學兵

740例HBV感染者血清HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥位點分析*

戴明佳，方圓，汪莉萍，武桂萍，石銀月，顏學兵

目的了解乙型肝炎病毒（HBV）感染者HBV基因型的構(gòu)成狀況及HBV P區(qū)基因變異的特點。方法對2010年8月～2011年10月送檢的740份HBV感染者血清，采用ABI基因測序儀檢測HBV耐藥位點和基因型，應用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果在740例HBV感染者中，檢出HBV B基因型40例（5.41%），C基因型695例（93.92%），D基因型5例（0.68%）；與拉米夫定、阿德福韋酯和恩替卡韋耐藥明確相關(guān)的位點突變377例（50.95%），其中195例（51.72%）患者既往有明確的應用核苷（酸）類似物（NA）史，在這195例發(fā)生耐藥的患者中，B基因型12例，C基因型183例，兩基因型間耐藥發(fā)生率無明顯差異，他們中包括CHB患者118例，肝硬化患者77例，主要耐藥變異模式為M204V+L180M、M204I、M204I+L180M和A181V，兩組間ALT、HBV DNA載量和主要耐藥變異模式檢出率均無統(tǒng)計學差異；HBV DNA載量是影響NA耐藥的相關(guān)因素（x2=0.496，P＜0.001），但耐藥與年齡、性別、疾病嚴重程度（CHB或肝硬化）和ALT水平無顯著性相關(guān)；此外，本文還檢出多處未知變異位點，如rt64、rt126、rt178和rt129等。結(jié)論核苷（酸）類似物的使用將伴隨病毒變異的發(fā)生，其耐藥基因變異位點具有一定的特點及規(guī)律性，動態(tài)監(jiān)測HBV DNA載量對早期發(fā)現(xiàn)耐藥有一定的價值。

乙型肝炎；突變；核苷（酸）類似物；耐藥

1 資料與方法

1.1 病例選擇740例患者均為2010年8月～2011年10月在我科住院和門診收治的HBV感染者。所有病例診斷均符合2005年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[3]。其中CHB患者432例，男性340例，女性92例；平均年齡（33.2±9.4）歲。乙型肝炎肝硬化（Liver cirrhosis，LC）患者308例，男性262例，女性46例；平均年齡（42.8±10.6）歲。所有患者均排除其他嗜肝病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷和遺傳代謝性肝病等。

1.2 檢測方法采用速率法檢測ALT（美國Abbott公司）；采用熒光定量PCR法檢測HBV DNA（上?？迫A生物工程股份有限公司，最低下限1000copies/ml）；采用毛細管電泳測序法檢測HBV基因型和耐藥變異（上海申友生物技術(shù)有限責任公司）。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（±s）表示，對各組HBV DNA水平行方差齊性檢驗，然后應用SNK法檢驗并進行兩兩比較，檢驗水準為α=0.05。率的比較采用x2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測情況在740例HBV感染者中，檢出HBV B基因型40例（5.41%），C基因型695例（93.92%），D基因型5例（0.68%）。

2.2 已知耐藥位點的變異模式在740例HBV感染者中，檢出與拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，ADV）和恩替卡韋（Entecavir，ETV）耐藥明確相關(guān)的位點突變377例（50.95%），其中195例患者既往有明確的應用NA史，包括B基因型12例，C基因型183例，兩基因型間耐藥發(fā)生率無明顯差異（P＞0.05）。在195例發(fā)生耐藥的患者中，CHB患者118例，LC患者77例，CHB和LC患者耐藥檢出率無統(tǒng)計學差異（x2=0.496，P＞0.05）。另182例發(fā)生耐藥的患者因既往用藥史不清楚，未進一步分析。

在118例CHB患者中，單用LAM耐藥突變77例，檢出3個耐藥突變位點（M204V/I、L180M、A181T），呈7種突變模式，以M204I/V+L180M、M204I、M204I多見；單用ADV耐藥突變13例，檢出2個耐藥突變位點（A181V/T、N236T），呈5種突變模式，以A181V多見；與LAM和ADV聯(lián)合/序貫治療相關(guān)的耐藥突變11例，檢出5個耐藥突變位點（A181V/T、N236T、L180M、M204V/I、V173L），呈7種突變模式，其中以L180M+M204V+V173L多見。在9例LAM耐藥后加用ADV的患者中，檢出4個耐藥突變位點（L180M、M204V/I、A181T、N236T），呈4種突變模式，以M204I+L180M居多；LAM與ETV序貫治療患者8例，檢出3個耐藥突變位點（L180M、M204V/I、S202G），呈3種突變模式，分別為M204V+L180M、M204I+L180M+S202G、M204V+L180M+S202G（表1）。

表1 118例CHB患者經(jīng)核苷（酸）類似物治療后病毒基因耐藥變異模式

在77例LC患者中，單用LAM耐藥突變57例，檢出4個耐藥突變位點（M204V/I、L180M、A181T/V、V173L），呈7種突變模式，仍以M204I/V+L180M、M204I、M204I多見；單用ADV耐藥突變8例，檢出2個耐藥突變位點（A181V/T、N236T），呈4種突變模式，也以A181V多見；與LAM和ADV聯(lián)合/序貫治療相關(guān)的耐藥突變5例，檢出4個耐藥突變位點（A181V/T、L180M、M204V、V173L），呈3種突變模式，其中以A181T多見。在3例LAM耐藥后加用ADV的患者中，檢出3個耐藥突變位點（L180M、M204I、A181T），呈2種突變模式，其中1例為A181T，2例為M204I+L180M突變；LAM與ETV序貫治療患者4例，檢出4個耐藥突變位點（L180M、M204V/I、V173L、S202G），呈3種突變模式，分別為M204V+L180M、M204I+L180M+V173L、M204V+L180M+S202G（表2）。

表2 77例LC患者經(jīng)核苷（酸）類似物治療后病毒基因耐藥變異模式

2.3 不同耐藥變異患者血清ALT和HBV DNA水平比較在CHB和LC患者中，耐藥發(fā)生頻率最高的變異模式分別為：M204V+L180M、M204I、M204I+L180M和A181V等四組，各組ALT和HBV DNA水平比較無統(tǒng)計學差異。CHB和LC患者主要耐藥變異模式發(fā)生頻率比較也無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3和表4。

表3 不同耐藥變異CHB患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比較

表3 不同耐藥變異CHB患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比較

變異模式例數(shù)ALT（U/L）HBV DNA（log10 copies/ml）M204V+L180M4252.67±36.775.67±1.32 M204I1658.38±34.825.78±1.72 M204I+L180M1453.15±23.295.48±1.44 A181V657.37±32.075.51±0.70

表4 不同耐藥變異LC患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比較

表4 不同耐藥變異LC患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比較

變異模式例數(shù)ALT（U/L）HBV DNA（log10 copies/ml）M204V+L180M2555.56±41.095.71±1.01 M204I1562.29±34.825.67±1.38 M204I+L180M1056.45±31.175.39±1.04 A181V460.41±38.135.13±0.83

2.4 耐藥相關(guān)因素分析在740例HBV感染者中，除外發(fā)生耐藥的377例（其中195例有明確的NA用藥史）外，另363例患者為應用NA治療但未發(fā)現(xiàn)已知耐藥相關(guān)位點，其中282例患者有完整的臨床資料。我們將195例應用NA且發(fā)生耐藥患者及282例應用NA未發(fā)生耐藥患者納入耐藥因素統(tǒng)計分析。將患者的年齡、性別、疾病分期、ALT水平、HBV DNA水平及服用NA種類作為耐藥相關(guān)因素進行單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平是影響NA耐藥的相關(guān)因素（表5）。

表5 影響病毒基因耐藥的單因素分析

2.5 其他變異位點在740例耐藥基因檢測中，發(fā)現(xiàn)了一些未見文獻報道或未經(jīng)體外實驗證實與NA耐藥相關(guān)的位點變異。其中出現(xiàn)頻率較高的變異位點分別為P64V/I 52例（7.03%），F(xiàn)178L/V 33例（4.46%），K154F/Y 31例（4.19%）。這些變異位點可以單獨出現(xiàn)，也可以與已知耐藥變異位點同時存在。目前尚未有文獻報道它們與NA耐藥具有明確相關(guān)性。

3 討論

在本研究中，發(fā)生NA耐藥的患者比例為LAM＞ADV＞ETV。LAM的耐藥突變位點臨床多見的主要是rtM204V/I和（或）rtL180M等，其中rtM204V/I又稱為YMDD變異，以rtM204I更為多見。有文獻報道YMDD的發(fā)生率可能與HBeAg和HBV DNA水平相關(guān)[4，5]。ADV耐藥變異較LAM少見，公認的耐藥相關(guān)變異位點是rtN236T和rtA181V/T。rtN236T不會顯著影響病毒對LAM的敏感性，但rtA181T/V突變株可與LAM發(fā)生部分交叉耐藥。此外，尚有報道rtQ215S/P/H、rtV214A、rtN238H、rtI233V、rtN118H、rtM207V、rtA200V和rtL180M等位點變異與HBV對ADV耐藥相關(guān)，這些變異位點被定義為繼發(fā)耐藥變異位點，但其重要性尚需進一步明確[6～8]。本研究發(fā)現(xiàn)8例rtQ215P/H/L位點變異患者，均對ADV耐藥。rtV214A變異22例，其中21例對ADV耐藥。因樣本量較小，這些變異位點與ADV的相關(guān)性仍需大規(guī)模臨床試驗研究及體外表型分析證實。

在134例單一應用LAM抗病毒治療的患者中，出現(xiàn)了3例rtA181T變異，1例rtA181V變異（伴隨rtV207I變異）。既往認為rtA181V只在接受ADV治療的患者中出現(xiàn)，但有研究顯示，此變異也可以在單一接受LAM治療的患者中出現(xiàn)，且181位點單一氨基酸改變即可能導致LAM和ADV交叉耐藥[9，10]。比起只接受單一NA治療的患者，rtA181多位點突變在有多種NA應用史的患者中出現(xiàn)得更為頻繁。

ETV耐藥基因屏障較高，至少有3個位點的堿基置換才能產(chǎn)生耐藥，即rtM204V和rtL180M，再加上rtT184、rtS202和（或）rtM250中的任一位點。本文共檢出16例ETV基因型耐藥，變異組合模式主要為rtM204V+rtL180M+rtS202G/H（8/16）。ETV在NA初治患者中的耐藥發(fā)生率很低，最初只在對LAM耐藥的病人中出現(xiàn)。有研究顯示應用ETV 3年累積耐藥率僅為1.7%～3.3%[11]，但有LAM治療失敗史的患者其耐藥發(fā)生率明顯增高，已證實rtM204V/I會降低對ETV的敏感性[12，13]。對于ETV治療失敗的患者，目前尚未達成統(tǒng)一的共識和規(guī)定，現(xiàn)主要主張為：1）換用ADV；2）LAM聯(lián)合ADV；3）IFN-α；4）替諾福韋[14]。

有文獻報道，接受NA治療的HBV感染者，其HBV DNA水平是發(fā)生耐藥的獨立危險因素，耐藥不只與基線HBV DNA水平有關(guān)，也與治療過程中的動態(tài)變化密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果與之相符。故在臨床中，密切監(jiān)測HBV DNA水平變化，可及早發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐藥的HBV感染者，有利于早期干預治療。

此外，我們在實驗中共發(fā)現(xiàn)了82個新的變異位點。其中變異頻率較高的位點為rt64、rt178、rt154、rt160和rt126等。rt64位點變異雖然頻率最高，但其單獨變異并未引起NA耐藥，且沒有證據(jù)證明其與NA耐藥相關(guān)。國外文獻報道S53N、T54N、L82M、S85A、I91L、Y126C、T128I/N、N139D、W153O和F166L等可能為HBV潛在耐藥變異位點，但這些位點尚未經(jīng)體內(nèi)外試驗證實。某些位點如rt84、rt126、rt139、rt153、rt191和rt233等變異僅發(fā)生于C基因型患者[16]。但本實驗在B基因型中也發(fā)現(xiàn)了rt84和rt126位點變異。

既往認為rtV84M和rtY126C可能與ADV耐藥有關(guān)。本研究中rt84變異表現(xiàn)為rtV84C/T或T/C雜合，其與ADV耐藥沒有相關(guān)性。12例rt126變異表現(xiàn)為rtY126G/C（5/12）、rtY126C/G（5/12）和rtY126C/T (2/12)，但這12例患者均不對ADV耐藥。

NA因其耐藥發(fā)生率日益增高，且價格較為昂貴，故臨床應用存在一定的局限性。目前，IFN-α聯(lián)合NA抗病毒治療方案已有初步研究報道。與IFN-α單一治療相比，IFN-α聯(lián)合ADV治療能提高CHB抗病毒的療效，尤其能提高HBV DNA陰轉(zhuǎn)率和HBeAg清除率[17]，且不增加不良事件，甚至可以降低ADV耐藥的發(fā)生。這無疑為早期部分單藥治療無效的患者帶來了福音，我們需要更多的臨床研究進一步探索聯(lián)合治療的療效和安全性。

[1]Holomn J，Glasa J.EASL clinical practice guidelines.J Hepatol，2009，51（3）:821-822.

[2]Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et al.Antiviral drug-resistant HBV:standardization of nomenclature and assays and recommendations for management.Hepatology，2007，46（1）: 254-265.

[3]中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會，肝病學分會.慢性乙型肝炎防治指南，實用肝臟病雜志，2006，9（1）：8-18.

[4]Shaw T，Bartholomeusz A，Locamini S.HBV drug resistance: mechanisms，detection and interpretation.J Hepatol，2006（2），44:593-606.

[5]Tan YW，Ge GH，Zhao W，et al.YMDD motif mutations in chronichepatitisBantiviraltreatmentnaivepatients:a multi-center study.Braz J Infect Dis，2012，16（3）:250-255.

[6]徐秋仙，張振綱，田德英，等.阿德福韋酯相關(guān)性HBV潛在耐藥變異位點研究進展.傳染病信息，2012，6（25）：186-189. [7]Bartholomeusz A，Locarnini S.Hepatitis B virus mutations associatedhepatitisB.KoreanJHepatol，2006，12（4）: 484-492.

[8]Zhong Y，Lv J，Li J，et al.Prevalence virology and antiviral drugssusceptibilityofhepatitisBvirusrtN238H polymerasemutationfrom1865Chinesepatientswith chronic hepatitis B.Antiviral Res，2012，93（1）:185-190.

[9]Gerolami R，Bourliere M，Colson P，et al.Unusual selection ofrtA181VHBVmutantscross-resistanttoadefovir following prolonged lamivudine monotherapy:report of two cases.Antivir Ther，2006，11:1103-1106.

[10]Villet S，Pichoud C，Billioud G，et al.Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure.J Hepatol，2008，48（5）:747-755.

[11]Yokosuka O，Takaguchi K，F(xiàn)ujioka S，et al.Long-term use of entecavir in nucleoside-naive Japanese patients with chronic hepatitis B infection.J Hepatol，2010，52（6）:791-799.

[12]Gish RG，Lok AS，Chang TT，et al.Entecavir therapy for up to96weeksinpatientswithHBeAg-positivechronic hepatitis B.Gastroenterology，2007，133（5）:1437-1444.

[13]ShermanM，YurdaydinC，SollanoJ，etal.Entecavirfor treatment of lamivudine-refractory，HBeAg-positive chronic hepatitis B.Gastroenterology，2006，130（7）:2039-2049.

[14]薛瑞霞，張繚云，楊松，等.恩替卡韋治療失敗的慢性乙型肝炎患者耐藥分析20例.世界華人消化雜志，2009，17（12）：1260-1263.

[15]楊方，張明香，魏倪，等.核苷（酸）類似物導致乙型肝炎病毒聚合酶區(qū)基因耐藥變異的影響因素.中華肝臟病雜志，2010，18（10）：789-790.

[16]LiuBM，LiT，XuJ，etal.Characterizationofpotential antiviral resistance mutations in hepatitis B virus reverse transcriptase sequences in treatment-naive Chinese patients. Antiviral Res，2010，85:512-519.

[17]Wang YD，Zhao CY，Wang W，et al.Improved efficacy by individualized combination therapy with Peg IFN-α 2a and ADV in HBeAg positive chronic hepatitis B patients.Hepatogastroenterology，2012，59（115）:680-686.

（收稿：2013-09-22）

（校對：陳從新）

Mutation of hepatitis B virus DNA reverse transcriptase in 740 patients with hepatitis B and liver cirrhosis

Dai Mingjia，F(xiàn)ang Yuan，Wang Liping，et al.Department of Infectious Disease，Affiliated Hospital，Xuzhou Medical College，Xuzhou221002，Jiangsu Province，China

Objective Hepatitis B virus （HBV）genotypes and pre-core mutations were studied in patients with HBV infection. Methods Viral DNA was extracted from serum samples of 740 patients with hepatitis B and liver cirrhosis from August 2010 to October 2011，and HBV genotypes and pre-core mutations were detected by ABI sequencing instrument. Results Among 740 patients with HBV infection，40（5.41%）were with HBV genotype B，695 （93.92%）were with genotype C，and 5 （0.68%）were with genotype D infection；377 （50.95%）patients carried mutations related to lamivudine，adefovir dipivoxil and entecavir resistance，among whom 195 patients （51.72%）has a definite history of application of nucleos（t）ide analog （NA）. Out of the 195 patients，there were 12 patients with HBV genotype B and 183 with genotype C infection. Also among these patients with definite NA history，118 patients were with CHB，and 77 patients were with liver cirrhosis，and the major resistant mutations were M204V+L180M，M204，M204I+L180M and A181V；Serum HBV DNA load was related to NA resistance（x2=0.496，P＜0.001），but not age，gender，disease severity （CHB or cirrhosis）and ALT levels；Besides，a number of new mutations，e.g. rt64，rt126，rt178，rt129 and so on were found in this series. Conclusions The administration of NA might results in mutation of hepatitis B virus and drug resistance，and the mutations have certain characteristics. Dynamic monitoring of serum HBV DNA load will help early detection of gene mutation and drug resistance.

Hepatitis B；Mutation；Nucleos（t）ide analog；Drug-resistant目前，抗HBV治療藥物有干擾素（IFN-α）和核苷（酸）類似物（Nucleoside analogue，NA）[1，2]。我們采用對PCR產(chǎn)物直接測序法對740例HBV感染者血清進行了HBV P區(qū)測序分析，以期了解與耐藥相關(guān)的基因變異特點及規(guī)律，從而指導患者的臨床合理用藥。

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.009

國家自然科學基金項目（編號：81371867）；2011年江蘇省“科教興衛(wèi)”醫(yī)學重點人才培養(yǎng)基金（編號：RC2011117）

221002 江蘇省徐州市徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院感染病科

戴明佳，女，27歲，碩士研究生。主要從事病毒性肝炎的臨床研究。E-mail:daimingjia1009@126.com

顏學兵，E-mail:yxbxuzhou@126.com