酒精性脂肪肝大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥模型的建立

張軍會，王永輝，周 然，王悅堯

·酒精性肝病·

酒精性脂肪肝大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥模型的建立

張軍會，王永輝，周 然，王悅堯

目的建立酒精性脂肪肝大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥模型。方法采用梯度酒精灌胃法早晚兩次灌胃，并以10%酒精為飲料，建立大鼠酒精性脂肪肝模型。分別于3w和6w檢測肝脂肪變、肝內(nèi)炎癥、肝功能和血清內(nèi)毒素水平。結果模型組自6w出現(xiàn)顯著的肝脂肪變，肝指數(shù)（3.6±0.2）、肝脂肪變積分（3.0±0.9）和炎癥積分（1.0±0.6）均顯著高于同期對照組水平[分別為（3.1±0.1）、（0.0±0.0）和（0.0±0.0），P＜0.05]；在6周時模型動物血漿內(nèi)毒素、血清D-乳酸、二胺氧化酶和AST分別為（1435.6±52.9）pg/ml、（20.7±5.4）mmol/L、（25.5±2.0）U/L和（124.5±13.2）U/L，較正常組均明顯升高[分別為（89.9±10.5）pg/ml、（5.0±1.1）mmol/L、（7.4±1.7）U/L和（40.4±15.2）U/L，P＜0.05]。結論用該方法連續(xù)6w成功建立單純性酒精性脂肪肝腸源性內(nèi)毒素血癥模型。

酒精性脂肪肝；腸源性內(nèi)毒素血癥；腸黏膜通透性；大鼠

深入研究酒精性肝病的發(fā)病機理，尋找有效的防治藥物及探討防治機制，需要建立一個可靠的動物模型。研究資料顯示：腸源性內(nèi)毒素是血液中內(nèi)毒素的主要來源，長期大量飲酒可引起酒精性肝病和血液內(nèi)毒素水平明顯升高[1]。內(nèi)毒素在酒精性肝病的發(fā)病和疾病的進展過程中的作用至關重要[2]。盡管目前建立酒精性肝病及內(nèi)毒素血癥動物模型的文獻報道較多，卻未見明確提出建立酒精性肝病和腸源性內(nèi)毒素血癥復合動物模型的報道。有鑒于此，本文就建立單純酒精性脂肪肝腸源性內(nèi)毒素血癥模型作了反復試驗，得到了較為可靠的造模方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑健康SPF級雄性SD大鼠100只[軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-（軍）2007-004]，體質(zhì)量220～250g；乳果糖口服液（北京韓美藥品有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市北辰方正試劑廠）。檢測大鼠內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）試劑盒和D-乳酸（D-lac-tate，D-LAC）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）試劑盒、丙轉(zhuǎn)氨氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒（微板法）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspertate aminotransferase，AST）測試盒（微板法，南京建成生物工程研究所）。

1.2 酒精性脂肪肝腸源性內(nèi)毒素血癥模型的建立取大鼠100只，隨機分為正常組（20只）、模型組（40只）和乳果糖處理組（40只）。模型組動物在1w以30%酒精15m1·kg-1·d-1（相當于純酒精4.5g·kg-1·d-1），2 w以40%酒精15m1·kg-1·d-1（6g·kg-1·d-1）和3 w及以后以50%酒精15m1·kg-1·d-1（7.5g·kg-1·d-1，每周根據(jù)動物體重變化調(diào)整劑量）灌胃，2次/d，同時給予10%酒精為唯一飲料；乳果糖組自3 w開始，給予模型動物乳果糖（1.35g·kg-1·d-1）灌胃，1次/d；正常組生理鹽水灌胃，2次/d，試驗周期為6 w。自3 w末開始每周每組于灌胃結束后2～24h內(nèi)隨機抽取6只動物，以水合氯醛腹腔注射麻醉后，在無菌條件下打開腹腔，于腹主動脈取血，分別置于有抗凝劑（除熱源）和無抗凝劑的試管中，離心，分別取血漿或血清，置-40℃冰箱低溫保存，備檢；迅速取下肝臟，生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，用電子天平稱量肝臟濕重，并計算肝指數(shù)[肝指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量（g）/動物體質(zhì)量（g）×100%][3，4]；取肝左葉，甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟細胞脂肪變性程度及炎癥程度，并根據(jù)中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的酒精性肝病診療指南（2010年修訂版）將肝脂肪變性分為4度（F0～4），將炎癥程度分為4級（G0～4）[5]，并分別計分為0～4分。

1.3 統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝指數(shù)變化見表1。

表1 各組大鼠肝指數(shù)（±s）比較

表1 各組大鼠肝指數(shù)（±s）比較

與正常組和乳果糖組比，①P＜0.05

2.2 肝臟組織病理學變化見表2。

表2 各組肝脂肪變性和炎癥程度計分（±s）的比較

表2 各組肝脂肪變性和炎癥程度計分（±s）的比較

與正常組比，①P＜0.05；與乳果糖組比，②P＜0.05

2.3 各組血清指標的比較見表3。

表3 各組血清指標（±s）的比較

表3 各組血清指標（±s）的比較

與正常組和乳果糖組比，①P＜0.01

3 討論

肝臟組織病理學檢查是判斷酒精性脂肪肝和酒精性肝炎的金標準，通過在光鏡下直接觀察，可以較準確地判斷組織是否有脂肪變性、炎細胞浸潤及其病變程度等[6]。

在正常情況下，腸道內(nèi)細菌產(chǎn)生大量的LPS，但在腸道的屏障作用下，僅有極少量的LPS通過腸壁進入血液循環(huán)，一般不會對人體造成損害[7]。長期飲酒可引起腸道菌群失調(diào)和腸黏膜屏障功能障礙，腸道產(chǎn)生的LPS便可大量吸收入血液循環(huán)，當超過肝臟的清除能力時即可造成血液LPS水平升高，造成器官功能損害，而肝臟是LPS損害的主要靶器官[8，9]。D-LAC是細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，哺乳動物組織不會產(chǎn)生D-LAC，被吸收入血的D-LAC也不能或僅能緩慢地被代謝清除。正常情況下血D-LAC水平很低，當腸粘膜生物屏障受到損害時，致腸粘膜通透性增加，腸道中細菌產(chǎn)生的大量D-LAC可通過受損粘膜經(jīng)循環(huán)入血，故血液D-LAC水平可及時反映腸粘膜通透性改變和腸粘膜損害程度[10]。DAO是具有高度活性的細胞內(nèi)酶類，95%以上存在于哺乳動物的小腸黏膜或纖毛上皮細胞中，當腸粘膜屏障功能損害時，DAO隨腸粘膜細胞脫落入腸腔而最終進入血液，使其血中活性升高。因此，血DAO活性可反映腸粘膜屏障功能的狀況[11，12]。

目前，在制備酒精性脂肪肝動物模型時多選用市售白酒，或白酒聯(lián)合高脂飼料。在白酒（或乙醇）聯(lián)合高脂飼料造出的模型中究竟是高脂飼料發(fā)揮了主要作用，還是白酒的作用，可能無法定論，因而存在弊端。本試驗以無水乙醇（分析純）為造模試劑，其純度高（乙醇質(zhì)量濃度≥99%）、雜質(zhì)少，排除了其它雜質(zhì)對造模的影響。

國外學者在對SD大鼠腸道微生態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，乳果糖可以抑制腸道有害細菌生長，增加腸道雙歧桿菌的活菌數(shù)量[13]。體外實驗證明：乳果糖可直接滅活試管內(nèi)和腸道內(nèi)的內(nèi)毒素[14]。人體試驗也證實口服乳果糖對腸源性內(nèi)毒素血癥有較好的治療作用[15]。

本組模型大鼠在實驗4w均出現(xiàn)肝細胞脂肪變性，但脂肪變程度仍較輕，5w則出現(xiàn)中、重度脂肪變性，但未見明顯的炎癥改變，在6w大多數(shù)出現(xiàn)較明顯的炎癥表現(xiàn)。模型動物在5w血漿LPS水平升高顯著，證實了內(nèi)毒素血癥的存在，5w血清DAO和D-LAC明顯升高，與內(nèi)毒素的升高呈平行關系，可作為血液中內(nèi)毒素為腸源性內(nèi)毒素的佐證。

在3～6w給予乳果糖灌胃后，模型動物血漿內(nèi)毒素水平明顯低于灌胃前水平（P＜0.05），可能與乳果糖改善了腸道的屏障功能，抑制了血清DAO和D-LAC水平有關。乳果糖在一定程度上還減緩了肝細胞脂肪變程度，抑制了酒精性脂肪肝向酒精性肝炎的轉(zhuǎn)化，可能與乳果糖通過降低血漿內(nèi)毒素水平，減弱了內(nèi)毒素對肝細胞的損傷有關。乳果糖的干預在一定程度上反證了模型動物血漿內(nèi)毒素為腸源性內(nèi)毒素。

長期飲酒是導致人類肝損傷的重要原因，也是血液內(nèi)毒素水平升高的主要原因。內(nèi)毒素血癥在酒精性肝病的發(fā)病和進展過程中的作用至關重要。本試驗成功建立了酒精性脂肪肝腸源性內(nèi)毒素血癥動物模型，將會為進一步研究內(nèi)毒素與肝損傷的作用機制及研發(fā)針對酒精性脂肪肝內(nèi)毒素血癥的新藥提供可靠的動物模型。

[1]方志紅，胡義揚，崔劍巍，等.大鼠酒精性肝損傷與腸內(nèi)毒素滲漏的關系及健脾理氣活血方的干預作用.中國中西醫(yī)結合雜志，2006，26（9）：813-817.

[2]茹清靜.脂肪性肝病.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：34.

[3]張瑤紓，吳志麗，王煥，等.桔梗對異煙肼和利福平致小鼠肝損傷的保護作用.天津醫(yī)科大學學報，2010，16（4）：577-579.

[4]勾春燕，閻海燕，尚宏偉，等.復方牛胎肝提取物減輕非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂肪變性及炎癥程度.中華肝臟病雜志，2009，17（2）：141-142.

[5]中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.酒精性肝病診療指南（2010年修訂版）.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：167-170.

[6]汪銳.中藥治療乙肝患者前后血清中AST、ALT及AST/ALT比值的變化.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2010，9（15）：1176-1177.

[7]馬思遠，張雅萍.腸源性內(nèi)毒素損害防治策略思考.中華燒傷雜志，2011，27（2）：125-127.

[8]黃古葉，毛德文.胡國平，等.大黃煎劑配合西藥治療慢性重型肝炎腸源性內(nèi)毒素血癥療效觀察.遼寧中醫(yī)雜志，2006，33（12）：1588-1589.

[9]王融冰，劉軍民，吳云忠，等.清毒湯治療肝病腸源性內(nèi)毒素癥臨床觀察.中西醫(yī)結合肝病雜志，2004，14（3）：135-137.

[10]Murray MI，Gonze MD，Nowak LR，et al．Serum D-lastate levels as all aid to diagnosing acute intestinal ischemia．Am J Surg，1994，167（6）：575-578．

[11]趙薇，李曉歐，婁國強，等.病毒性肝炎后肝硬化患者腸道的通透性.中華傳染病雜志，2002，20（2）：105-107．

[12]于淑霞，王惠吉.肝硬化患者腸通透性及乳果糖對其影響的研究.臨床肝膽病雜志，2006，22（2）：108-110.

[13]Bielecka M，Biedrzycka E，Majkowska A，et a1．Effect of nondigestible oligosaccharides on gut microecosystem in rats．Food Res Inter，2002，35：139-144.

[14]于中麟，錢林學.乳果糖在肝病中的應用.中華內(nèi)科雜志，1996，35（2）：65-66.

[15]張順財，戴茜，王吉耀，等.口服乳果糖對肝病腸源性內(nèi)毒素血癥及細胞因子的影響.中華肝臟病雜志，2000，8（3）：185.

（收稿：2013-09-06）

（校對：陳從新）

Establishment of experimental model of alcoholic fatty liver accompanied with intestinal endotoxemia in rats

Zhang Junhui，Wang Yonghui，Zhou Ran，et al.
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，Sichuan Province，China

ObjectiveTo establish an experimental model of alcoholic fatty liver accompanied with intestinal endotoxemia in rats.MethodsA rat model of alcoholic fatty liver was established by gradient ethanol gavage method；The liver steatosis，intrahepatic inflammation，liver function tests and serum lipopolysaccharide were determined at 3 and 6 weeks of experiment.ResultSignificant liver steatosis was observed after 6 weeks of ethanol administration in the model rats；The liver index，liver steatosis scores，inflammation scores in model rats were（3.6± 0.2），（3.0±0.9）and（1.0±0.6），respectively，significantly higher than those in normal controls[（3.1±0.1），（0.0±0.0）and（0.0±0.0），respectively，P＜0.05）]；Similarly，serum lipopolysaccharide，D-lactate，diamine oxidase and aspertate aminotransferase levels in model rats at 6 months were（1435.6±52.9）pg/ml，（20.7±5.4）mmol/L，（25.5±2.0）U/L and（124.5±13.2）U/L，which were also significantly higher than those in normal controls[（89.9±10.5）pg/ml，（5.0± 1.1）mmol/L，（7.4±1.7）U/L and（40.4±15.2）U/L，respectively，P＜0.05].ConclusionA rat model of alcoholic fatty liver accompanied with intestinal endotoxemia can be successfully establish by using gradient ethanol gavage for 6 weeks.

Alcoholic fatty liver；Intestinal endotoxemia；Permeability of intestinal mucosa；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.005

610075成都市成都中醫(yī)藥大學（張軍會，王悅堯）；山西中醫(yī)學院（張軍會，王永輝，周然，王悅堯）

張軍會，男，33歲，博士研究生，講師。主要從事方劑臨床應用、作用的物質(zhì)基礎及其機理研究。E-mail：522610483@qq. com