秀麗隱桿線蟲抗銅突變體的篩選及SNP定位

宋少娟，郭亞平，張學(xué)堯，張建珍，馬恩波

1. 山西大學(xué)應(yīng)用生物研究所，太原 030006；

2. 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

秀麗隱桿線蟲抗銅突變體的篩選及SNP定位

宋少娟1，郭亞平2，張學(xué)堯1，張建珍1，馬恩波1

1. 山西大學(xué)應(yīng)用生物研究所，太原 030006；

2. 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

銅在有機(jī)體代謝過程中發(fā)揮著重要作用，但過量可產(chǎn)生毒害效應(yīng)。文章以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)為模式生物，尋找多細(xì)胞生物中銅代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因。采用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變秀麗隱桿線蟲，通過100 000個(gè)雜合基因組的篩選得到兩個(gè)抗銅突變體ms1和ms2。在篩選培養(yǎng)基上野生型停止發(fā)育，而抗銅突變體則可發(fā)育到成蟲，且抗銅性狀能穩(wěn)定遺傳。與N2的回交實(shí)驗(yàn)表明，ms1的抗銅表型可能由單基因隱性突變導(dǎo)致，ms2的抗銅表型消失，可能是由多基因突變引起。以 CB4856和 ms1作為親本，構(gòu)建了F2群，經(jīng)SNP定位，確定ms1突變位點(diǎn)位于染色體II(LGII)上，進(jìn)一步對(duì)LGII染色體上的8個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行分析，將ms1的突變位點(diǎn)定位在LGII:-6附近。秀麗隱桿線蟲抗銅突變體ms1的篩選和定位可為深入研究線蟲銅代謝及調(diào)控的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

秀麗隱桿線蟲；正向遺傳篩選；抗銅；突變體；SNP定位

銅在生物體廣泛存在且具有重要的生理功能，生物體主要通過銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、銅分子伴侶和小分子螯合劑等共同調(diào)節(jié)銅的穩(wěn)態(tài)。在哺乳動(dòng)物中，細(xì)胞外的Cu2+由steap2和Dyctb還原為Cu1+，通過hCTR1 (Human copper transporters 1)和DMT1(Dvalent metal transporter 1)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，之后可參與到以下代謝途徑中：(1)與Cox17(Cytochrome c oxidase)結(jié)合傳遞給線粒體內(nèi)膜上的細(xì)胞色素C氧化酶，參與到呼吸鏈中；(2)與CCS(Copper chaperone for SOD1)結(jié)合傳遞給 SOD(Superoxide dismutase)緩解氧化壓力；(3)與Atox1(Antioxidant 1 copper chaperone)結(jié)合呈遞給ATP7A(Copper-transporting ATPase 1)排出胞外；(4)與金屬硫蛋白 MT(Metallothionein)結(jié)合降低其毒害作用[1]。這些銅代謝途徑障礙則會(huì)引發(fā)人的遺傳疾病，主要包括 Menkes綜合征和肝豆?fàn)詈俗冃?。Menkes綜合征是腸道上皮基底膜ATP7A失活，導(dǎo)致機(jī)體不能正常從食物中吸收 Cu2+而引起嚴(yán)重的銅缺乏；肝豆?fàn)詈俗冃詣t是 ATP7B(P-type ATPase)失活導(dǎo)致機(jī)體銅排出障礙而引起嚴(yán)重的銅中毒[2]。在細(xì)菌中組成型胞外多糖可以非特異性地結(jié)合胞外銅離子，減輕其對(duì)細(xì)菌的毒性[3]，另外cue(銅排出系統(tǒng))、cus(胞質(zhì)銅解毒系統(tǒng))、pco(抗銅質(zhì)粒)和 cop(抗銅質(zhì)粒)系統(tǒng)能夠特異性地識(shí)別銅離子并緩解其毒性[4]；在植物中銅代謝還受miR398的調(diào)節(jié)[5]。目前，多細(xì)胞動(dòng)物中抗銅突變體的研究報(bào)道還很少。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)為重要的模式生物，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等方面的研究[6]。線蟲銅代謝基因高度保守，其基因組中有10個(gè)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR-like)、2個(gè)銅分子伴侶(CUTC-1、CUC-1)和 1個(gè)銅排出蛋白(CUA-1)[7～11]。將cutc-1進(jìn)行 RNA干擾后可增加線蟲對(duì)銅的敏感性[8]。過表達(dá)半分子腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 hmt-1可減輕過量銅的毒性[12]。長(zhǎng)壽基因daf-2和age-1缺失也可增強(qiáng)對(duì)銅的抗性[13]。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，過量銅能夠延遲線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育[14]。但迄今為止，參與調(diào)節(jié)銅代謝及調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚不完全明確。

1974年Brenner發(fā)現(xiàn)EMS化學(xué)誘變劑具有很高的誘變效率[15]，且突變體的基因可以定位克隆，這也是正向遺傳篩選的最大優(yōu)點(diǎn)[16]。之后經(jīng)過不斷改進(jìn)，利用化學(xué)誘變劑EMS和基因定位對(duì)線蟲進(jìn)行大規(guī)模正向遺傳學(xué)篩選，已成為基因功能研究的重要手段[17,18]。目前，在基因定位過程中，分子標(biāo)記已經(jīng)逐步取代了傳統(tǒng)的表型觀察。在分子標(biāo)記的發(fā)展過程中，單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是繼隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA標(biāo)記(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)[19]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restricted fragment length polymorphism, RFLP)和微衛(wèi)星標(biāo)記(Simple sequence repeat, SSR)之后的又一種新的分子標(biāo)記，可檢測(cè)同一物種不同個(gè)體間染色體上單個(gè)堿基的變化，通常呈雙等位基因多態(tài)性[20]，目前已成功應(yīng)用于突變體的篩選和基因定位[21～23]。

本文將秀麗隱桿線蟲進(jìn)行大規(guī)模化學(xué)誘變，正向遺傳篩選抗銅突變體，并采用SNP進(jìn)行初步定位，為突變體基因的定位和克隆及研究線蟲銅代謝調(diào)控的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)資料和理論模型。

1 材料和方法

1.1 線蟲培養(yǎng)和同步化

線蟲培養(yǎng)采用NGM培養(yǎng)基(1.7% 瓊脂、2.5 g/L蛋白胨、25 mmol/L NaCl、5 mg/L膽固醇、25 mmol/L KPO4緩沖液pH 6.0(108.3 g KH2PO4、35.6 g K2HPO4，加水到1 L)、1 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2)，于 20℃喂食大腸桿菌 OP50[16]。實(shí)驗(yàn)中用到的英國(guó)源線蟲N2和夏威夷源線蟲CB4856均由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所楊崇林課題組提供，以野生型N2為母本進(jìn)行誘變和篩選，CB4856用于SNP定位。線蟲同步化按照 Wormbook的標(biāo)準(zhǔn)方法：用M9緩沖液(3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 mol/L MgSO41 mL，加水到1 L)收集懷卵的成蟲，2000 r/min離心1 min，棄上清，加入1 mL bleach buffer(0.5% NaClO、0.5 mol/L NaOH)，渦旋震蕩5 min，用M9清洗5～6次，得到卵，孵化后為同步化的L1[24]。

1.2 篩選培養(yǎng)基

卵放在加入不同濃度CuSO4的NGM培養(yǎng)基(0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2、0.25、0.4、0.5、0.6、0.8、1、1.2 mmol/L)上，連續(xù)觀察4 d，記錄能夠發(fā)育到成蟲的比例，每個(gè)濃度 3個(gè)重復(fù)。導(dǎo)致所有卵均不能發(fā)育到成蟲的濃度作為篩選濃度，并據(jù)此配制成含銅的篩選培養(yǎng)基。

1.3 誘變

用EMS按照標(biāo)準(zhǔn)方法誘變N2[18]。配制0.2 mol/L EMS母液，15 mL離心管加入2 mL M9 buffer和0.2 mL EMS母液；取另外一支15 mL離心管，M9 buffer 清洗同步發(fā)育的N2 L4線蟲3～4次，留2 mL 液體，加入第一支15 mL離心管中。室溫50 r/min培養(yǎng)4 h后離心清洗。取沉淀0.2～0.5 mL 放置在NGM培養(yǎng)基上，2 h后，5只P0分一個(gè)板，共分100個(gè)板，自交兩代。

1.4 篩選

收集誘變后的F2卵，放在含銅的篩選培養(yǎng)基上，4～7 d后發(fā)育為成蟲的，挑出并單獨(dú)放在NGM培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。之后收集500～1000枚卵于含銅篩選培養(yǎng)基上，若有＞10%個(gè)體能夠在4～7 d后發(fā)育為成蟲，則為抗銅突變體，且抗銅特性能夠穩(wěn)定遺傳。實(shí)驗(yàn)共篩選了約100 000個(gè)單倍體基因組。

1.5 回交

對(duì)篩選到的突變體進(jìn)行回交，即突變體雄蟲與野生型P0雌雄同體雜交，挑選雜交后代F1，每板1只，共6～10只，擴(kuò)大培養(yǎng)F2，F(xiàn)3卵放在篩選培養(yǎng)基上，篩選純合突變體，進(jìn)行下一次回交。4次回交完成后則得到遺傳背景較為單一的抗銅突變體，且可能為點(diǎn)突變。

1.6 DNA提取和PCR擴(kuò)增

線蟲DNA提取采用蛋白酶K法[25]，將50只線蟲放于50 μL線蟲裂解液(20 mmol/L Tris pH 7.5、50 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、0.5% SDS、100 μg/mL蛋白酶K)中，液氮速凍，65℃ 1 h，95℃滅活15 min，作為PCR模板。PCR 擴(kuò)增采用20 μL體系：10×PCR buffer (Mg2+free)2 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，0.1 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L引物 0.5 μL，5 U/μL taq 酶 0.2 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)齊到20 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃8 min。Dra I(NEB)15 μL體系酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 SNP定位染色體

本文采用 SNP分子標(biāo)記基于自由組合定律對(duì)ms1進(jìn)行了初步定位(圖1)。CB4856和N2品系相比，各條染色體有眾多的SNP差異。CB4856與突變體雜交的F1產(chǎn)生配子時(shí)，來自父母本的非同源染色體將發(fā)生自由組合。在抗銅表型的F3中，與突變位點(diǎn)在同一條染色體上的SNP，發(fā)生自由組合的概率低，而其他染色體則符合自由組合定律。具體方法為：用CB4856與突變體雜交，挑出約20～40個(gè)F1雜合子，每個(gè)F1單獨(dú)培養(yǎng)，待其成熟產(chǎn)卵時(shí)，加入bleach buffer，收集F2卵，在篩選培養(yǎng)基上挑出正常生長(zhǎng)發(fā)育的線蟲擴(kuò)大培養(yǎng)，得到突變位點(diǎn)純合子F2系。參考Davis方法[23]找到染色體中部能被 Dra I(TTT^AAA)識(shí)別切割的SNP位點(diǎn)，合成引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，確定突變基因的染色體定位。CB4856的 SNPs經(jīng)網(wǎng)站查詢(http://genome. wustl.edu/services/c-elegans-snpdata/)。

圖1 SNP染色體定位策略示意圖(參考Wormbook[24]，略做修改)P0：父本為夏威夷(Hawaii)源線蟲(CB4856)，母本為突變體，細(xì)線為N2源片段，粗線為CB4856源片段。雜交后，如果突變基因與SNP標(biāo)簽不連鎖，則F2代中CB4856源片段和N2源片段約為1：1。如果突變基因與SNP標(biāo)簽連鎖，則F2代中 N2源片段超過2/3。

表1 染色體定位所需SNP多態(tài)性標(biāo)簽[22]

圖2 SNP染色體內(nèi)定位策略示意圖(參考Wormbook[24]，略做修改)P0：父本為 CB4856，母本為突變體。細(xì)線為 N2源片段，粗線為CB4856源片段。雜交后，ms1突變基因以外的部分可能被交換成CB4856源片段，越接近突變基因的部分發(fā)生交換的概率越低，因此在ms1附近區(qū)域進(jìn)行SNP酶切時(shí)呈現(xiàn)N2源酶切帶型的概率越高。

1.8 SNP染色體內(nèi)定位

確定突變體所在的染色體后，為了進(jìn)行染色體內(nèi)的初步定位，基于連鎖交換定律，采用圖2所示策略，在相應(yīng)的染色體區(qū)段尋找新的 SNP標(biāo)簽(表2)。圖2中的兩個(gè)標(biāo)識(shí)SNP標(biāo)簽被染色體遠(yuǎn)端的SNP標(biāo)簽替代，離突變位點(diǎn)越近，被交換的概率越低，從而確定基因的遺傳圖譜位置[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CuSO4對(duì)線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響

圖3A顯示對(duì)照組在4 d內(nèi)發(fā)育到成蟲，處理組隨著銅濃度的提高，線蟲生長(zhǎng)發(fā)育受阻，停留在L1幼蟲期直至死亡，一旦L1線蟲蛻皮到L2階段，可緩慢發(fā)育到成蟲，同時(shí)隨著CuSO4濃度的增加，線蟲能夠發(fā)育到成蟲的數(shù)量明顯降低。當(dāng)CuSO4濃度達(dá)到0.6 mmol/L時(shí)，可完全阻止野生型線蟲所有的卵發(fā)育到成蟲，在更高濃度銅離子處理下，線蟲全部停留在L1幼蟲階段。結(jié)果表明，線蟲停止發(fā)育的半有效劑量EC50約為0.52 mmol/L，全有效劑量EC100為0.6 mmol/L。

表2 II號(hào)染色體SNP多態(tài)性標(biāo)簽[22]

圖3 不同濃度CuSO4對(duì)線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響A：線蟲卵的存活率和成蟲率隨著銅濃度的升高而降低，當(dāng)CuSO4濃度達(dá)到0.6 mmol/L時(shí)線蟲停止發(fā)育；B：突變體ms1在0.6～1.2 mmol/L CuSO4濃度下成蟲率均顯著高于野生型。

2.2 正向遺傳篩選線蟲抗銅突變體

本文選擇0.8 mmol/L CuSO4的NGM培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，經(jīng)EMS誘變篩選后，得到2個(gè)抗銅突變體，分別命名為ms1和ms2。ms1回交4次，后代均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗銅表型，表明ms1的抗銅表型是由基因突變引起的(圖 4)。ms2在回交過程中，抗性消失，可能是多基因突變引起的。

圖4 ms1在篩選培養(yǎng)基上發(fā)育到成蟲A：N2 在普通的NGM上96 h后發(fā)育到成蟲；B：N2在含0.8 mmol/L CuSO4的篩選培養(yǎng)基上停止發(fā)育；C：ms1在篩選培養(yǎng)基上96 h后發(fā)育到成蟲。比例尺為50 μm。

采用不同濃度CuSO4處理ms1和N2(圖3B)，共設(shè)11個(gè)濃度，每組3個(gè)重復(fù)，每一個(gè)樣本約100個(gè)卵，96 h后，觀察記錄發(fā)育到成蟲的線蟲數(shù)量，進(jìn)一步分析ms1對(duì)銅的抗性水平。結(jié)果顯示，N2在0.8 mmol/L CuSO4篩選培養(yǎng)基上96 h后仍然停留在L1階段，而ms1在相同濃度下能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育。在0.6～1 mmol/L CuSO4濃度下，ms1的成蟲率從76%降到17%，每一組都比相同濃度下野生型N2的成蟲率顯著性增高(P＜0.05，t-test)。N2的EC50約0.5 mmol/L，而ms1的EC50約0.8 mmol/L，是N2的1.6倍(圖3)。ms1對(duì)銅有顯著抗性(圖3B)，同時(shí)觀察到ms1在正常 NGM培養(yǎng)條件下其形態(tài)結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)方式?jīng)]有明顯變化。

2.3 ms1突變基因的染色體定位

將CB4856的卵放在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，100%的線蟲停留在 L1階段，表明銅在篩選培養(yǎng)基上對(duì)CB4856發(fā)育的抑制效應(yīng)與野生型N2相似，突變體的抗銅表型可以從CB4856的背景中分離出來。

用CB4856雄性與ms1雜交，得到F1雜合子。F2卵放于篩選培養(yǎng)基上，挑出正常生長(zhǎng)到成蟲的抗銅純合子，擴(kuò)大培養(yǎng)。這些F2系線蟲的突變位點(diǎn)是純合子，因此所在染色體的SNP標(biāo)簽絕大多數(shù)來源于N2源，其他染色體的SNP標(biāo)簽則符合自由組合定律(圖5)。本文分離到36個(gè)單獨(dú)的抗銅純合子，提取DNA，按順序編號(hào)用于分析。

選取染色體中間位置的 SNP標(biāo)記(圖 5)，分析每個(gè)染色體 SNP分子標(biāo)記基因型(表 1)。對(duì)每一個(gè)F2系的DNA進(jìn)行PCR、酶切和電泳分析(圖5)，計(jì)算N2源片段純合子的概率。結(jié)果顯示16個(gè)F2系，染色體II(LGII)中全部含有N2源片段，只有3個(gè)含有CB4856源片段，即在染色體II染色體中間位置約有91%的N2源片段，染色體I、III、IV、V、X染色體上約有47%～75%的N2源片段(圖5)，因此確定ms1突變位點(diǎn)位于染色體II上。

2.4 ms1突變基因的遺傳位置

采用圖2所示策略，選取新的SNP標(biāo)簽。由于ms1位于染色體II上，所以在該染色體上重新選擇了8個(gè)SNP標(biāo)簽，覆蓋-18～+22的遺傳距離(表2)。酶切鑒定結(jié)果如表3所示，當(dāng)酶切進(jìn)行到標(biāo)簽-6時(shí)交換概率降為1，據(jù)此確定ms1位于遺傳圖譜LGII:-6附近。

圖5 ms1染色體定位共檢測(cè)了32條染色體，其中LGI染色體有21個(gè)N2源片段；LGII染色體有29個(gè)N2源片段；LGIII染色體有24個(gè)N2源片段；LGIV染色體有20個(gè)N2源片段；LGV染色體有21個(gè)N2源片段；LGX染色體有19個(gè)N2 源片段。

表3 SNP酶切定位鑒定結(jié)果

3 討 論

銅代謝是生物體基本的生理代謝途徑[1]，銅中毒可引起人體食欲減退、精神沉郁、嘔吐、腹瀉、蒼白無力、呼吸困難、顫抖、死胎和流產(chǎn)等，嚴(yán)重危害人體健康[2]。全面了解參與銅代謝基因的分子機(jī)制，例如銅如何被生物體吸收，穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；生物體如何在銅過量和缺乏時(shí)啟動(dòng)相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制等，有助于深入探索這一復(fù)雜的代謝過程。本文以秀麗隱桿線蟲為研究對(duì)象，采用正向遺傳學(xué)方法，通過對(duì)全基因組進(jìn)行隨機(jī)化學(xué)誘變，篩選到與銅代謝相關(guān)的突變體。

線蟲突變體在篩選培養(yǎng)基上的正常生長(zhǎng)發(fā)育與野生型停止生長(zhǎng)發(fā)育的表型對(duì)于篩選、回交和基因定位至關(guān)重要。本文通過觀察分析不同濃度 CuSO4對(duì)野生型線蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mmol/L時(shí)N2線蟲全部停止發(fā)育(圖2)，為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，本文確定篩選培養(yǎng)基的濃度為 0.8 mmol/L CuSO4，在此濃度下所有的卵均不能正常發(fā)育到成蟲。

由于線蟲是雌雄同體，L4是生殖細(xì)胞成熟時(shí)期，故采用EMS處理L4線蟲[16]。EMS可直接滲入線蟲體內(nèi)烷基化堿基，原始生殖細(xì)胞的DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配，導(dǎo)致生殖細(xì)胞點(diǎn)突變發(fā)生，主要是G:C變?yōu)锳:T。EMS誘變后，自交，收集F2卵在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行突變體的初步篩選和分類，從而可有效地發(fā)現(xiàn)隱性突變基因的表型[18]。確認(rèn)抗銅表型后，根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，對(duì)F3代回交，不僅可方便地區(qū)分出多基因遺傳缺陷、單基因遺傳缺陷和耐受性增加，還可以消除誘變過程中產(chǎn)生的隨機(jī)無效突變。通過上述方法，本文篩選得到抗銅突變體ms1和ms2。其中ms2在回交過程中，抗銅表型消失，其原因可能是EMS同時(shí)導(dǎo)致線蟲基因組多處點(diǎn)突變，在回交的過程中這些基因分離，導(dǎo)致抗銅表型消失。

突變體的簡(jiǎn)單快速定位作為正向遺傳篩選的主要手段，在研究基因功能方面具有重要意義?；蚨ㄎ坏慕?jīng)典方法是利用突變基因(控制特定表型)與遺傳標(biāo)記的連鎖分析，SNP屬于第三代分子標(biāo)記。秀麗隱桿線蟲全基因組測(cè)序完成，由于地理隔離和遺傳漂移，夏威夷線蟲(CB4856)和英國(guó)線蟲(N2)平均每隔1000個(gè)堿基就有1個(gè)SNP位點(diǎn)[23]，也為采用單核苷酸多態(tài)(SNP)分子標(biāo)記進(jìn)行突變體定位提供了有利條件。與傳統(tǒng)定位方法相比，線蟲SNP分子標(biāo)記定位具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)SNP標(biāo)簽多位于基因組無功能區(qū)，因此不會(huì)干擾所要觀察的表型；(2)目前已發(fā)現(xiàn)了大量的 SNP標(biāo)簽(http://genome.wustl. edu/services/c-elegans-snpdata/)，為進(jìn)一步的深入研究提供了條件；(3)線蟲SNP標(biāo)記的遺傳和物理距離均已知，有利于基因的準(zhǔn)確定位，因此，目前 SNP標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于線蟲突變基因定位[22]。本研究以SNP為標(biāo)記，對(duì)突變體的突變位點(diǎn)進(jìn)行定位，ms1(N2背景)與CB4856雜交，得到經(jīng)同源重組的純合突變F2系。根據(jù)經(jīng)典的兩點(diǎn)定位法進(jìn)行遺傳作圖，選擇檢測(cè)中間位置的SNP定位染色體，這樣即便突變基因位于染色體遠(yuǎn)端(25)，純合突變F2系中也有約56%的N2/N2 SNP(38% N2/CB, 6% CB/CB)[24]。在進(jìn)行染色體內(nèi)定位時(shí)，本文選擇了約平均分布的8個(gè)SNP位點(diǎn)(表 2)，根據(jù)連鎖交換定律，離突變位點(diǎn)越近，發(fā)生交換的概率越低。如表3所示，LGII:-6位置發(fā)生交換的概率最低，表明突變基因位于附近。本文得到 36個(gè)純合突變 F2系，只能粗略地定位在染色體上較大范圍的區(qū)間6～7 cM，如進(jìn)一步的精細(xì)定位，則需要更多的F2系。

ms1對(duì)過量銅產(chǎn)生抗性(圖 2B)，推測(cè)其產(chǎn)生的抗銅表型可能有兩個(gè)原因：一是銅吸收減少或排出增加；二是ms1對(duì)過量銅的耐受性增加。同時(shí)已報(bào)道銅抗性相關(guān)基因遺傳位置為：10個(gè) ctr同源基因(LGI:-0.01、I:-14.71、I:-14.71、I:-14.71、II:0.11、IV:4.35、IV:4.35、IV:4.35、V:-2.97、X:23.94)、1個(gè)銅排出基因cua-1 (LGIII:21)、2個(gè)銅分子伴侶cuc-1 (LGIII:-0.54)和cutc-1 (LGIII:-0.27)、2個(gè)金屬硫蛋白mtl-1 (LGV:0.13)和mtl-2 (LGV:6.07)、兩個(gè)長(zhǎng)壽基因daf-2 (LGIII:-8.03)和age-1 (LGII:3.61)、3個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子運(yùn)輸?shù)鞍谆?smf-1 (LGX:-2.53)、smf-2 (LGX:-2.53)和smf-3 (LGIV:-6.93)[25]都不在本文所定位的區(qū)域。據(jù)此推測(cè)ms1的突變基因可能是參與銅代謝的新基因或是已有基因的新功能，從而為了解銅代謝及調(diào)控的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)材料。

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[24] 線蟲基因數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站: www.wormbase.org.

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(責(zé)任編委: 苗 龍)

Screening and SNP mapping of copper-resistant mutations in C. elegans

Shaojuan Song1, Yaping Guo2, Xueyao Zhang1, Jianzhen Zhang1, Enbo Ma1

1. Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
2. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

Copper plays critical roles in biological system; however, it is toxic in excess. To identify novel genes involved in copper metabolism, we performed a whole genome-wide genetic screen in C. elegans model organism to search for mutants which are resistant to excessive copper. Wild type (N2) L4worms were mutagenized with ethylmethane sulfonate (EMS), and the F2progeny were screened on culture medium with excess copper. Two copper-resistant mutants, ms1 and ms2, were recovered from the screening of 100 000 hyploid genomes. No obvious developmental defects were observed in ms1 and ms2 mutants, and they were able to grow into adults on screen medium plate, but N2 worms arrested in L1stage. Results of backcross test suggested that copper-resistant phenotype in ms1 may be controlled by a single recessive gene, but probably there are mutations in multiple genes in ms2, as no copper resistant worms could be found in F2progeny when ms2 mutants were backcrossed with N2 worms. To determine the mutation positions of ms1, we employed single nucleotide polymorphisms (SNPs) mapping. Our map-ping results indicated that ms1 mutation is on chromosome II (LGII). By analysis of 8 SNP markers from -18 to 23 on LGII, we found that ms1 mutation is at approximately LGII:-6. Further study on ms1 mutants will provide insights into copper metabolism and its regulation.

Caenorhabditis elegans; forward genetic screen; copper resistance; mutant; SNP mapping

2014-05-12;

2014-06-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31071980)資助

宋少娟，博士研究生，研究方向：動(dòng)物生化與分子生物學(xué)。E-mail: songshaojuan@126.com

馬恩波，博士，教授，研究方向：動(dòng)物生化與分子生物學(xué)。E-mail: maenbo2003@sxu.edu.cn

致 謝: 感謝中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所楊崇林研究員和劉鍇博士在本文的設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)和成文過程中給予的指導(dǎo)和幫助。感謝衛(wèi)青博士(Mayo Clinic, Rochester, MN，美國(guó)明尼蘇達(dá)州，羅切斯特，梅奧醫(yī)學(xué)中心)幫助修改英文摘要。

10.3724/SP.J.1005.2014.1261

時(shí)間: 2014-10-10 16:11:18

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141010.1611.002.html