發(fā)形霞水母觸手提取物的蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性

常銀龍，肖良，鄭杰民，王倩倩，張黎明(第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系海洋生物技術(shù)教研室，上海 200433)

·論著·

發(fā)形霞水母觸手提取物的蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性

常銀龍，肖良，鄭杰民，王倩倩，張黎明(第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系海洋生物技術(shù)教研室，上海 200433)

目的 探討不同環(huán)境因素和處理方法對(duì)發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)觸手提取物(tentacle extract，TE)蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響。方法結(jié)合蛋白濃度測(cè)定、溶血活性檢測(cè)和SDS-PAGE分析等方法研究不同環(huán)境因素和處理方法對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響。結(jié)果TE溶血活性呈明顯的劑量依賴關(guān)系，其半數(shù)溶血分?jǐn)?shù)HU50=226μg/ml; 40℃水浴1 h，能去除TE中大量雜蛋白，但仍保持顯著溶血活性;TE在4℃放置28 d，其溶血活性保持穩(wěn)定，25℃下3 d內(nèi)其溶血活性變化不明顯;pH值對(duì)TE溶血活性的影響呈鐘形曲線，在pH 6.0～11.0之間活性相對(duì)穩(wěn)定，pH 8.0是TE保持溶血活性的最優(yōu)pH條件;不同緩沖液對(duì)TE穩(wěn)定性及其溶血活性影響顯著，濃度大于26%的硫酸銨溶液對(duì)TE溶血蛋白具有良好的鹽析作用。結(jié)論40℃水浴1 h預(yù)處理可顯著減少TE中非活性蛋白組分，并降低樣品黏性;4℃和pH 8.0是TE保持蛋白穩(wěn)定性和溶血活性的最適條件;濃度大于26%的硫酸銨鹽析有利于溶血蛋白組分富集。

發(fā)形霞水母;觸手提取物;穩(wěn)定性;溶血活性

水母屬刺胞動(dòng)物門，是一類低等的海洋浮游動(dòng)物，廣泛分布于全球各海域。水母蜇傷是最常見(jiàn)的海洋生物傷，可以產(chǎn)生多種局部或全身癥狀，全世界每年被水母蜇傷的患者數(shù)以萬(wàn)計(jì)，致死者亦不在少數(shù)，給濱海旅游、近海漁業(yè)和水下作業(yè)帶來(lái)了極大的困擾［1，2］。研究表明，水母毒素是結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特的肽類毒素，具有溶血活性、酶活性、神經(jīng)毒性、皮膚壞死和肌肉毒性、肝臟毒性以及心臟毒性等多種生物學(xué)活性［1，3-5］。由于對(duì)熱不穩(wěn)定和易與分離介質(zhì)黏附或自身聚集，水母毒素的分離純化進(jìn)展緩慢，明顯落后于其他常見(jiàn)的生物毒素。

水母毒素粗毒樣品主要有觸手提取物(tentacle extract，TE)和刺絲囊毒素(crude nematocyst venom，cNV)兩種，其中TE制備簡(jiǎn)便，可大量獲取，且活性保持良好，這是其有利于毒素分離純化的一面;但另一方面，TE含有大量非毒性的組織蛋白，大大增加了分離純化的復(fù)雜程度。我們?cè)噲D通過(guò)改變各種理化參數(shù)，去除粗毒樣品TE中的非毒性組織蛋白，并降低其黏性，以利于后續(xù)分離純化工作的開(kāi)展。本研究以容易檢測(cè)的溶血活性為追蹤手段，結(jié)合蛋白濃度測(cè)定、SDS-PAGE分析等方法，改變樣品所處的理化條件，以觀察發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)TE的蛋白穩(wěn)定性，優(yōu)化其保存和使用條件，為活性蛋白的分離純化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 發(fā)形霞水母觸手提取物的制備新鮮發(fā)形霞水母(由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院洪惠馨教授鑒定)樣品于2011年6月采自浙江省三門灣。TE的制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)［6］，Bradford法測(cè)定TE的蛋白濃度［7］。

1.2 溶血活性測(cè)定和SDS-PAGE分析SD大鼠(200～250 g)，用25%烏拉坦腹腔注射麻醉(1.2 g/kg)。抽取大鼠尾靜脈血，等體積50 U肝素生理鹽水抗凝，用PBS洗滌數(shù)次，每次洗滌后1 000×g離心5 min，棄上清液，直至上清液清亮為止。紅細(xì)胞與PBS按體積比1∶200(0.5%)稀釋成紅細(xì)胞懸液。反應(yīng)總體積0.2 ml，紅細(xì)胞懸液0.1 ml，加入0.1 ml TE(或處理后TE)樣品，另設(shè)加0.1 ml PBS的陰性對(duì)照組與加0.1 ml 0.2 mg/ml SDS的陽(yáng)性對(duì)照組。37℃水浴30min，1 000×g離心5min，吸取上清液150μl用酶標(biāo)儀檢測(cè)A415，計(jì)算溶血分?jǐn)?shù)。溶血分?jǐn)?shù)=(樣品管A415-陰性對(duì)照A415)/(陽(yáng)性對(duì)照A415-陰性對(duì)照A415)×100%。

將TE及其處理后的樣品、蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠分別采用5%積層膠和12%分離膠，單孔上樣20μl，積層膠和分離膠電壓分別采用80 V和160 V，考馬斯亮藍(lán)快速染色法染色，0.25 mol/L KCl溶液脫色。

1.3 不同環(huán)境因素和處理方法對(duì)TE溶血活性的影響

1.3.1 TE溶血活性的劑量反應(yīng)關(guān)系TE濃度梯度為0.043、0.086、0.172、0.257、0.343、0.515、0.687、0. 858、1.030、1.202、1.373、1.545和1.717 mg/ml，測(cè)定不同濃度TE樣品的溶血活性。

1.3.2 溫度對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

將TE分別在4、25、40、60、80以及100℃條件下放置60min，然后10 000×g離心10min，收集上清液，檢測(cè)上清液的蛋白濃度、溶血活性并進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.3.3 放置時(shí)間對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響在4℃和25℃條件下，將TE分別放置1、2、4、6、12、24 h及2、3、7、14、21和28 d，然后10 000×g離心10min，收集上清液，檢測(cè)上清液的蛋白濃度、溶血活性并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.4 pH值對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響將等量的TE分別在不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)的PBS中透析10 h，然后10 000×g離心10 min，收集上清液，檢測(cè)上清液的蛋白濃度、溶血活性并進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.3.5 緩沖液對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響將等量的TE分別用20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、20mmol/L Na2HPO4(pH 8.0)、20 mmol/L HAc (pH 6.0)、20 mmol/L NH4Ac(pH 6.0)、50 mmol/L Na2HPO4+1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0)、H2O等6種不同緩沖液透析24 h，然后10 000×g離心10min，收集上清液(上清液一)、沉淀，向沉淀加入等量PBS溶液，用移液器反復(fù)吹吸、混勻，所得樣品用PBS再透

析24 h，10 000×g離心10 min，收集上清液(上清液二)，沉淀再加入等量PBS重懸(沉淀復(fù)溶物)，檢測(cè)上清液一、上清液二和沉淀復(fù)溶物的蛋白濃度、溶血活性并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3.6 硫酸銨溶液對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響將等量的TE分別用濃度為15%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%的硫酸銨溶液透析24 h，10 000×g離心10 min，收集上清液，沉淀加入等量PBS重懸，再用PBS透析24 h后，檢測(cè)上清液和沉淀復(fù)溶物的蛋白濃度、溶血活性并進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。計(jì)量資料以ˉx±s表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間在方差齊性的基礎(chǔ)上采用單因素方差分析，不同時(shí)相點(diǎn)和組間差異的整體比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。

2 結(jié)果

圖1 TE溶血活性的劑量反應(yīng)曲線

2.1 TE溶血活性的劑量反應(yīng)關(guān)系發(fā)形霞水母TE對(duì)大鼠紅細(xì)胞有明顯溶血活性，且隨著TE蛋白濃度增加而溶血分?jǐn)?shù)逐漸增大，溶血活性劑量反應(yīng)曲線呈“S”形(圖1)。TE的半數(shù)溶血分?jǐn)?shù)HU50為226μg/ml，TE蛋白濃度為515μg/ml時(shí)，溶血分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值。但由于檢測(cè)樣品溶血活性時(shí)，測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照SDS的吸光度值低于樣品的吸光度值，因此，按溶血分?jǐn)?shù)公式計(jì)算會(huì)得到溶血分?jǐn)?shù)大于100%的數(shù)值。

2.2 溫度對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響圖2(A、B)是溫度對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響。4、25℃條件下放置60 min對(duì)TE蛋白濃度和溶血活性無(wú)影響;40℃條件下放置60 min，TE蛋白濃度顯著下降而溶血活性變化不大;60℃條件下放置60 min，TE蛋白濃度顯著下降，其溶血活性也降低近一半;80、100℃條件下放置60 min，TE蛋白濃度下降幅度較40、60℃時(shí)小，但溶血活性顯著降低甚至喪失。SDS-PAGE分析(圖2C)表明，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量＞72 000的蛋白條帶較4、25℃時(shí)明顯減少。

圖2 溫度對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

2.3 放置時(shí)間對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響4℃條件下(圖3A、B)，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)TE蛋白濃度逐漸降低，至28 d時(shí)，降低約20%，但TE溶血活性幾乎保持不變，SDS-PAGE(圖3C)顯示其蛋白條帶無(wú)明顯變化。25℃條件下(圖4A、B)，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)TE蛋白濃度逐漸降低，至28 d時(shí)，降低約69%，其溶血活性在3 d內(nèi)保持不變，3 d后開(kāi)始降低，至7 d時(shí)，TE基本無(wú)溶血活性，SDS-PAGE顯示其蛋白條帶的數(shù)量和密度7 d后都略有下降(基本同圖3C)。

圖3 4℃條件下放置不同時(shí)間對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

圖4 25℃條件下放置不同時(shí)間對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

2.4 pH對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

在不同pH值條件下(圖5)，TE的蛋白濃度與溶血活性均呈鐘形曲線。pH 6.0～11.0范圍內(nèi)，TE的溶血活性變化不大，pH 2.0～5.0以及pH 12.0時(shí)溶血活性顯著下降甚至完全喪失，pH 8.0是TE保持溶血活性的最優(yōu)pH條件。強(qiáng)酸尤其是強(qiáng)堿性條件下，TE蛋白濃度顯著下降。

圖5 pH值對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

2.5 緩沖液對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

圖6(A、B)是緩沖液對(duì)TE上清液一蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響。經(jīng)6種緩沖液透析24 h后，TE蛋白濃度都明顯下降，其中50 mmol/L Na2HPO4+1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0)緩沖液透析后的TE濃度下降最為明顯，蛋白濃度趨向于0(0.056 mg/ml)。各組緩沖液透析后的上清液一均無(wú)溶血活性。圖6C為上清液一的SDS-PAGE圖。

圖6 不同緩沖液對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

圖6(D、E)是緩沖液對(duì)TE上清液二蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響。經(jīng)6種緩沖液透析、離心等處理獲得的上清液二，它們的蛋白濃度范圍為0.2～0.5mg/ml;溶血活性以20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)組最強(qiáng)，其次是50 mmol/L Na2HPO4+ 1.5mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0)組，再次是20mmol/ L Na2HPO4(pH 8.0)組和20 mmol/L NH4Ac(pH 6. 0)組，但20 mmol/L HAc(pH 6.0)組幾乎沒(méi)有溶血活性。SDS-PAGE(圖6F)顯示，6組上清液二的高亮蛋白條帶與TE基本一致。

圖6(G、H)是緩沖液對(duì)TE沉淀復(fù)溶物蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響。6組沉淀復(fù)溶物的蛋白濃度都＜0.36 mg/m l;除50 mmol/L Na2HPO4+1. 5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0)組外，其他沉淀復(fù)溶物都有很強(qiáng)的溶血活性;SDS-PAGE(圖6I)顯示，6組沉淀復(fù)溶物的高亮蛋白條帶與TE分布一致，但條帶總數(shù)明顯減少。

2.6 硫酸銨溶液對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響圖7(A、B)是硫酸銨溶液對(duì)TE上清液蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響，硫酸銨濃度在15%～24%之間，上清液溶血活性隨著硫酸銨濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到26%時(shí)，上清液蛋白濃度突然顯著下降，此時(shí)溶血活性也幾乎消失。28%～35%硫酸銨溶液透析獲得的上清液基本無(wú)蛋白條帶。硫酸銨溶液對(duì)TE沉淀蛋白濃度和溶血活性的影響則正好與上清液相反(圖7D、E、F)。綜合分析可知，濃度＞26%的硫酸銨溶液對(duì)TE中的溶血蛋白具有良好的鹽析作用。

圖7 15%～35%硫酸銨溶液對(duì)TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性的影響

3 討論

水母粗毒樣品主要有刺絲囊毒素和觸手提取物兩種。刺絲囊毒素是水母蜇傷中毒的直接毒性成分，常用于水母蜇傷中毒機(jī)制及其防治研究［8］。本課題組提出觸手提取物可作為刺絲囊毒素替代品［6］，用于水母蜇傷中毒、水母毒素純化與鑒定等研究。通過(guò)改變所用處理?xiàng)l件，可以降低觸手提取物雜蛋白濃度和黏性，使其樣品量大、活性易于保持的特點(diǎn)突顯出來(lái)，從而為水母毒素活性蛋白組分的分離純化、水母蜇傷防治研究提供一條新的途徑。

在0.52 mg/ml濃度以內(nèi)，TE的溶血活性呈“S”形曲線，具有明顯的劑量依賴性，與馮金華等［9］報(bào)道的劑量反應(yīng)關(guān)系一致。溫度對(duì)水母毒素的溶血活性影響顯著，比如從箱形水母(Carybdea alata，也稱海黃蜂)中提取的毒液，其溶血活性在45℃時(shí)急劇下降，煮沸后活性消失［10］;37℃時(shí)，地中海水母Rhopilema nomadica的毒液沒(méi)有溶血活性［11］，因此，Nomura等［12］報(bào)道，箱水母(Carybdea alata)蜇傷中毒后最有效的現(xiàn)場(chǎng)處理方法是用熱水浸泡蜇傷部位。溫度對(duì)TE穩(wěn)定性影響的觀察結(jié)果耐人尋味，40℃水浴60 min時(shí)，TE溶血活性變化不大，但蛋白濃度降低顯著，SDS-PAGE顯示幾條高亮的大分子蛋白條帶密度明顯下降，說(shuō)明40℃水浴1 h預(yù)處理可以減少TE中非活性蛋白組分，并降低樣品黏性。溫度低于40℃時(shí)，溶血活性、蛋白濃度以及SDS-PAGE蛋白條帶變化都不大;溫度高于40℃時(shí)，溶血活性迅速下降，60℃水浴60 min溶血活性下降一半，至80、100℃時(shí)幾乎消失，但此時(shí)蛋白濃度反而高于40℃時(shí)的濃度值。筆者推測(cè)，40℃時(shí)蛋白濃度下降最為明顯的原因可能與觸手組織中含有大量的蛋白酶有關(guān)，40℃可能是這些蛋白酶催化作用的適宜溫度。4℃條件下放置28 d蛋白濃度略有下降，但溶血活性幾乎沒(méi)有下降，25℃條件下放置28 d時(shí)蛋白濃度較4℃放置下降明顯，溶血活性在3 d內(nèi)基本保持不變，提示水母溶血蛋白在一定時(shí)間內(nèi)可在常溫(25℃)進(jìn)行純化，不必?fù)?dān)心溫度條件所致的溶血蛋白活性消失。pH值對(duì)TE溶血活性的影響呈鐘形曲線，pH 8.0是TE保持溶血活性的最優(yōu)pH條件，pH 6.0～11.0范圍內(nèi)，TE的溶血活性變化不大。另外，強(qiáng)酸尤其是強(qiáng)堿性pH會(huì)導(dǎo)致TE大量的蛋白沉淀出現(xiàn)，SDS-PAGE顯示，沉淀去除的主要部分是相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為26 000～43 000的蛋白，而對(duì)溶血蛋白的影響并不明顯。

改變TE所處的緩沖液環(huán)境會(huì)導(dǎo)致大量的蛋白沉淀出現(xiàn)，說(shuō)明TE蛋白易受緩沖液的影響而不穩(wěn)定，水母毒素蛋白的不穩(wěn)定性是阻礙其分離純化的主要難點(diǎn)之一［4］。本研究組采用的6種透析緩沖液全部都出現(xiàn)沉淀，并且溶血蛋白也一并沉淀下來(lái)，采用PBS復(fù)溶后部分沉淀重新溶解，遺憾的是大部分溶血蛋白不能夠被重新溶解，仍存在沉淀中。盡管沉淀部分溶血活性非常強(qiáng)烈，且SDS-PAGE顯示沉淀中的蛋白條帶要比TE少很多，但如何在保持溶血活性的前提下有效重新溶解蛋白沉淀，進(jìn)入下一步的色譜分離仍是個(gè)難題。李榮鋒等［13］利用硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)沙蜇(Stomolophusmeleagris)毒素粗提液進(jìn)行初步分離純化，從50%硫酸銨沉淀中純化得到抗氧化活性蛋白SmP90。本研究中一個(gè)有趣的現(xiàn)象是緩沖液50 mmol/L Na2HPO4+1.5 mol/L(NH4)2SO4(pH 7.0)可以將溶血蛋白“沉淀”，但又可以被PBS很好地重新溶解，筆者利用硫酸銨分級(jí)沉淀和透析相結(jié)合的方法處理TE，通過(guò)“沉淀”作用實(shí)現(xiàn)大量富集溶血蛋白組分，發(fā)現(xiàn)濃度＞26%的硫酸銨溶液對(duì)TE中的溶血蛋白具有良好的鹽析作用。

總之，TE蛋白穩(wěn)定性及其溶血活性受各種環(huán)境因素的影響顯著，40℃水浴1 h預(yù)處理可以減少TE中非活性蛋白組分，并降低樣品黏性;4℃和pH 8.0的理化環(huán)境是TE保持蛋白穩(wěn)定性和溶血活性的最適條件;濃度＞26%的硫酸銨溶液可大量富集溶血蛋白組分，純化前的預(yù)處理和純化過(guò)程中保持最適理化條件，有利于進(jìn)一步分離純化溶血蛋白。

［1］Tibballs J.Australian venomous jellyfish，envenomation syndromes，toxins and therapy［J］.Toxicon，2006，48(7):830-859.

［2］Kang C，Munawir A，Cha M，et al.Cytotoxicity and hemolytic activity of jellyfish Nemopilema nomurai(Scyphozoa:Rhizostomeae)venom［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2009，150(1):85-90.

［3］Helmholz H，Ruhnau C，Schutt C，et al.Comparative study on the cell toxicity and enzymatic activity of two northern scyphozoan species Cyanea capillata(L)and Cyanea lamarckii(Peron＆Leslieur)［J］.Toxicon，2007，50(1):53-64.

［4］Brinkman DL，Burnell JN.Biochemical andmolecular characterisation of cubozoan protein toxins［J］.Toxicon，2009，54(8): 1162-1173.

［5］Suput D.In vivo effects of cnidarian toxins and venoms.Toxicon，2009，54(8):1190-1200.

［6］Xiao L，He Q，Guo YF，etal.Cyanea capillata tentacle-only extract as a potential alternative of nematocyst venom:its cardiovascular toxicity and tolerance to isolation and purification procedures［J］.Toxicon，2009，53(1):146-152.

［7］Bradford MM.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248-254.

［8］Rocha J，Peixe L，Gomes NCM，etal.Cnidarians as a source of new marine bioactive compounds-an overview of the last decade and future steps for bioprospecting［J］.Marine Drugs，2011，9 (10):1860-1886.

［9］Feng J，Yu H，Xing R，et al.Partial characterization of the hemolytic activity of the nematocyst venom from the jellyfish Cyanea nozakii kishinouye［J］.Toxicol In Vitro，2010，24(6):1750-1756.

［10］Chung JJ，Ratnapala LA，Cooke IM，et al.Partial purification and characterization of a hemolysin(CAH1)from Hawaiian box jellyfish(Carybdea alata)venom［J］.Toxicon，2001，39(7): 981-990.

［11］Gusmani L，Avian M，Galil B，etal.Biologically active polypeptides in the venom of the jellyfish Rhopilema nomadica［J］.Toxicon，1997，35(5):637-648.

［12］Nomura JT，Sato RL，Ahern RM，etal.A randomized paired comparison trial of cutaneous treatments for acute jellyfish(Carybdea alata)stings［J］.Am JEmerg Med，2002，20(7):624-626.

［13］Li R，Yu H，Xing R，et al.Isolation，identification and characterization of a novel antioxidant protein from the nematocyst of the jellyfish Stomolophusmeleagris［J］.Int JBiol Macromol，2012，51(3):274-278.

Protein stability and hemolytic activity of tentacle extract from the jellyfish Cyanea capillata

CHANG Yinlong，XIAO liang，ZHENG Jiemin，WANG Qianqian，ZHANG Liming(Department of Marine Biotechnology，F(xiàn)aculty of Naval Medicine，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toinvestigate the influencing factors of the protein stability and hemolytic activity of tentacle extract (TE)from the jellyfish Cyanea capillata.MethodsEffects of various factors and treatments on the protein stability and hemolytic activity of TE were explored by protein detection，hemolytic assay and SDS-PAGE analysis.ResultsTE caused a significant and dosedependent hemolytic effect，and the HU50of TE against0.5%erythrocyte suspensions from SD ratswas 226μg/ml.A 40℃water bath for 1 hour could effectively remove the contaminating proteins in TE.TE retained hemolytic activity at4℃for 28 days but itwas unstable when kept at25℃over 3 days.TE was active in the range from pH 6.0 to 11.0 and the optimum pH was 8.0.Various buffer solutions had significantly different effects on the stability and hemolytic activity of TE，and a good salting-out effect was observed on the hemolytic protein of TE while the concentration of ammonium sulfate solutions was greater than26%.Conclusion A 40℃water bath for 1 hour could effectively remove the contaminating proteins in TE and reduce its viscosity.The optimum conditions formaintaining stability and hemolytic activity of TEwere 4℃and pH 8.0.The salting-outeffect from 26%andmore ammonium sulfate solutionswould be conducive to the enrichment of hemolytic protein.

Cyanea capillata;tentacle extract;stability;hemolytic activity

Q5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［文章編號(hào)］1006-0111(2014)06-0434-06

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.009

2013-11-25

2014-07-07［本文編輯］李睿旻

國(guó)家自然科學(xué)基金(41176126;81370833).

常銀龍，碩士研究生.E-mail:donlone@yeah.net.

張黎明，教授，博士生導(dǎo)師.Tel:(021)81871128，E-mail:lmzhang1969@163.com.