高效液相色譜法測定己酮可可堿腸溶片中己酮可可堿含量

孟祥云，代文婷，高雷，邢海燕，陳進（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬合肥醫(yī)院/合肥市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽合肥230011）

高效液相色譜法測定己酮可可堿腸溶片中己酮可可堿含量

孟祥云，代文婷，高雷，邢海燕，陳進（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬合肥醫(yī)院/合肥市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽合肥230011）

目的建立測定己酮可可堿腸溶片中己酮可可堿含量的方法。方法采用高效液相色譜法測定己酮可可堿含量。色譜柱：COSMILC18柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）；檢測波長：272 nm；流動相：甲醇-0.544%磷酸二氫鉀溶液（48∶52）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。結(jié)果己酮可可堿質(zhì)量濃度為60.25～140.59 μg/mL時峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系（R2=1.000）。3批樣品的平均含量分別為99.91%、99.95%、99.89%。結(jié)論高效液相色譜方法專屬性強、方便、快捷，適用于測定己酮可可堿腸溶片中己酮可可堿的含量。

色譜法，高壓液相；己酮可可堿；腸溶片

己酮可可堿為可可豆堿的衍生物，是非選擇性磷酸二酯酶抑制藥，為非特異性外周血管擴張藥[1]。己酮可可堿及其代謝產(chǎn)物通過降低血液黏度而改善血液流變性，可增加慢性外周動脈血管疾病患者受累微循環(huán)的血流，提高其組織供氧量[2]。該藥可劑量依賴性地降低血液黏度、提高紅細胞變形性、改善白細胞的血液流變特性，并能抑制嗜中性粒細胞的黏附和激活。其主要適用于腦部血液循環(huán)障礙如暫時性腦缺血發(fā)作、腦卒中后遺癥、腦缺血引起的腦功能障礙[3]；保護心血管，改善慢性心力衰竭及特發(fā)性擴張性心肌病患者心功能的作用[4]；外周血液循環(huán)障礙性疾病如血栓栓塞性脈管炎、腹部動脈血液循環(huán)障礙、間歇性跛行或靜息痛、神經(jīng)病理性疼痛[5]；內(nèi)耳循環(huán)障礙如突發(fā)性耳聾、老年性耳鳴及耳聾；眼部血液循環(huán)障礙[6]。有研究表明，己酮可可堿尚可治療女子不孕癥及男子不育癥[7-9]。該藥生物半衰期短、血藥濃度波動大，可引起胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)。將其研制成腸溶制劑，以減少其不良反應(yīng)[10-11]。為進一步控制制劑的質(zhì)量，該研究建立了高效液相色譜法測定己酮可可堿腸溶片中己酮可可堿的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀，DAD檢測器，AB135-S型1/100 000天平（德國梅特勒公司），BCD-225CHC冰箱（合肥美菱公司），KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），UV-1750紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.1.2 試劑己酮可可堿對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100591-200501）、咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊幤飞镏破窓z定所提供，批號：17125-200809）、己酮可可堿腸溶片（自制）、娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈非?？蓸酚邢薰?，批號：20130213）、甲醇為色譜純、其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：COSMILC18柱（4.6mm×250.0mm，5.0μm）；流動相：甲醇-0.544%磷酸二氫鉀溶液（48∶52）；檢測波長：272 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備稱取咖啡因?qū)φ掌?.32 mg，己酮可可堿對照品5.14 mg置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

1.2.3 陰性對照溶液的制備按處方比例，稱取除己酮可可堿外的輔料62.3 mg，置于50 mL量瓶中，加流動相超聲溶解10 min并稀釋至刻度，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對照溶液。

1.2.4 供試品溶液的制備取本品20片，精密稱定，充分研細，稱取230.30 mg置于50 mL量瓶中，加流動相超聲溶解10 min并稀釋至刻度，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.5 方法學(xué)驗證

1.2.5.1 專屬性試驗分別精密量取10 μL供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液注入高效液相色譜儀，在1.2.1項色譜條件下測定。

1.2.5.2 線性回歸精密稱取己酮可可堿對照品50.21 mg，置于50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取各對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，在1.2.1項色譜條件下測定，記錄峰面積。以峰面積（A）對濃度（C）作圖并進行線性回歸。

1.2.5.3 精密度試驗稱取己酮可可堿對照品19.63、20.06、19.38、24.61、25.10、24.43、29.11、30.09、29.41 mg置于50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。分別量取各對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，在1.2.1項色譜條件下測定，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.5.4 中間精密度試驗稱取己酮可可堿對照品19.47、18.80、19.03、23.65、23.69、23.91、28.67、28.01、29.20 mg置于50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別量取各對照品溶液10 μL，在不同時間，由不同人員在不同機器上測定峰面積。

1.2.5.5 回收率試驗稱取己酮可可堿對照品25.21mg，置于50mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。稱取己酮可可堿對照品20.11、19.44、19.75、24.27、24.64、24.53、29.83、29.16、30.14 mg分別置于50 mL量瓶中，按處方比例加入空白輔料，加流動相超聲并稀釋至刻度，振搖，濾過，量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別量取對照品溶液和供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，在1.2.1項色譜條件下測定，記錄峰面積，計算回收率。

1.2.5.6 溶液穩(wěn)定性試驗稱取己酮可可堿對照品25.13 mg，置于25mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置于50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密稱取本品118.3 mg，同法制備供試品溶液。分別在0、1、2、4、6、8 h測定對照品溶液和供試品溶液的峰面積。

1.2.5.7 含量測定稱取己酮可可堿對照品23.62 mg置于50 mL量瓶中，加流動相超聲溶解10 min并稀釋到刻度，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取本品20片，精密稱定，充分研細，精密稱取適量，置于50 mL量瓶中，加流動相超聲溶解10 min并稀釋至刻度，搖勻，濾過，量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密量取對照品溶液和供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，在1.2.1項色譜條件下測定，記錄峰面積，計算含量。作者制備樣品3批，批號分別為130501、130502、130503，每批分別取樣品。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗輔料峰對己酮可可堿的含量測定無干擾，咖啡因峰與己酮可可堿峰的分離度為7.5，理論塔板數(shù)按己酮可可堿峰計算為8 020，己酮可可堿保留時間為5.35 min。結(jié)果表明該方法專屬性強。見圖1、2、3。

2.2 線性回歸線性方程：A=19.222C+10.777，R2=1.000。結(jié)果表明，己酮可可堿質(zhì)量濃度為60.25～140.59 μg/mL時，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗RSD為0.10%，表明該方法精密度良好，符合方法學(xué)要求。

2.4 中間精密度試驗RSD為0.14%，表明該方法精密度良好，符合方法學(xué)要求。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 陰性對照溶液色譜圖

圖3 供試品溶液色譜圖

2.5 回收率試驗平均回收率為99.95%，RSD為0.40%。結(jié)果表明，回收率試驗中己酮可可堿與空白輔料不發(fā)生吸附作用，可以認(rèn)為其對含量測定基本無影響，此法符合要求。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗該制劑在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 含量測定見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 己酮可可堿為可可豆堿的衍生物，該藥生物半衰期短、血藥濃度波動大，可引起胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)。己酮可可堿可引起胃腸道不良反應(yīng)，作者將其研制成腸溶制劑。

3.2 選擇己酮可可堿最大吸收波長272 nm為分析波長，檢測靈敏度高，輔料不干擾分析測定。使用甲醇-0.544%磷酸二氫鉀溶液（48∶52）為流動相，咖啡因峰與己酮可可堿峰的分離度好，理論塔板數(shù)高，己酮可可堿保留時間合適，因此該色譜條件適合該制劑的含量測定。

3.3 參照《中國藥典2010年版二部附錄ⅤD》，本研究采用高效液相色譜法測定己酮可可堿腸溶片中己酮可可堿的含量，結(jié)果顯示，各批號制劑之間己酮可可堿的含量差異很小，本研究結(jié)果表明，該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，因此，該方法可作為該制劑質(zhì)量控制的方法。

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Content determination of pentoxifylline in pentoxifylline enteric-coated tablets by HPLC

Meng Xiangyun，Dai Wenting，Gao Lei，Xing Haiyan，Chen Jin（Department of Pharmacy，the Affiliated Hefei Hospital of Anhui Medical University/Hefei Municipal Second People′s Hospital，Hefei，Anhui 230011，China）

ObjectiveTo establish a method for the content determination of pentoxifylline in pentoxifylline entericcoated tablets.MethodsHigh-performance liquid chromatography（HPLC）was used to determine the content of pentoxifylline. The chromatographic column was COSMILC18（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）；the detection wavelength was 272 nm；the mobile phase was methanol-0.544%monopotassium phosphate（48∶52）；the column temperature was 30℃；the flow velocity was 1.0 mL/min，and the injection volumn was 20 μL.ResultsWhen the concentrations of pentoxifylline was in the range of 60.25-140.59 μg/mL，the peak area had good linear relationship with concentration（R2=1.000）.The average contents of pentoxifylline in three batches of samples were 99.91%，99.95%，99.89%respectively.ConclusionThe HPLC is specific，convenient and fast，it is suitable for content determination of drugs in pentoxifylline enteric-coated tablets.

Chromatography，high pressure liquid；Pentoxifylline；Enteric-coated tablets

10.3969/j.issn.1009-5519.2014.09.015

A

1009-5519（2014）09-1315-02

2013-12-20）

孟祥云（1970-），男，安徽肥東人，主管藥師，主要從事藥事管理及臨床藥學(xué)工作；E-mail：hfmxy70@163.com。