煙草赤星病拮抗芽胞桿菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化

羅楚翔，彭 建，楊 歡，陳建剛，王昌軍，李進(jìn)平，施河麗，祁高富，陳守文*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，武漢 430040；3.武漢黃鶴樓香精香料有限公司，武漢 430040；4.武漢樂陽生物科技有限公司，武漢 430075；5.湖北省煙草科研所，武漢 430030；6.恩施州煙草公司科技中心，湖北 恩施 445000）

煙草是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。歷年煙草病害調(diào)查報(bào)告表明煙草赤星病是煙葉種植成熟期的主要真菌病害。1892年首次在美國發(fā)現(xiàn)煙草赤星病，我國自1916年開始在北京附近發(fā)現(xiàn)后，該病在全國各大煙區(qū)都有發(fā)生，對(duì)煙草行業(yè)造成嚴(yán)重的損失[1]。煙草赤星病的防治采用抗病育種、農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治的方法。目前國內(nèi)主要采用種植抗（耐）病品種及栽培防治為主、藥劑防治為輔的綜合防治措施，防治上大多采用化學(xué)方法[2-4]。由于對(duì)煙草品質(zhì)的要求逐步提高，對(duì)成熟期病害的防治不宜采用有殘留的化學(xué)藥劑，使用拮抗微生物達(dá)到防治植物病害的目的是植物病害防治的重要組成部分[5-8]。

生防芽胞桿菌對(duì)煙草赤星病的防治在國內(nèi)外都有相關(guān)報(bào)道，很多研究都是處在可控制的實(shí)驗(yàn)室條件下展開的。Fravel等[9]從煙葉表面分離篩選出的Bacillus cereus subsp.mycoids菌株在控制溫度和濕度的溫和條件下能有效控制煙草赤星病情的發(fā)展。李安娜等[10]從煙草葉圍或根際的105株微生物中，分離篩選到 7株抑菌作用明顯的菌株，其中B102對(duì)煙草赤星病的拮抗作用顯著，其抑菌帶寬度達(dá)13 mm。

芽胞桿菌的主要生防機(jī)制是競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、誘導(dǎo)植物抗性和促生作用[11-13]，其突出的特征是能產(chǎn)生耐熱抗逆的內(nèi)生芽胞，這有利于生防菌劑的生產(chǎn)、加工和保存，也有利于菌體在環(huán)境中存活與定殖[14-15]。作者從實(shí)驗(yàn)室保存的 93株芽胞桿菌中分離了3株煙草赤星病拮抗菌，挑選其中效果最好的1株進(jìn)行了生物學(xué)鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，顯著提高了其發(fā)酵生物量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及煙草 長柄鏈格孢菌（Alternaria longipes ACCC 30002）；93株芽胞桿菌（本實(shí)驗(yàn)室保存）；煙草K326（感赤星病品種）。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，滅菌前pH 7.4；PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，蔗糖20.0 g/L，去皮馬鈴薯切成塊狀后煮沸30 min，4層紗布過濾后，濾液加入蔗糖，并補(bǔ)充蒸餾水至 1000 mL，瓊脂18.0 g，滅菌前pH調(diào)節(jié)至6.6；Waksman培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，瓊脂18.0 g/L，滅菌前pH 6.8；發(fā)酵培養(yǎng)基（KMB）：甘油20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，K2HPO4·3H2O 1.5 g/L，滅菌前pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 芽胞桿菌培養(yǎng) 菌種活化：將-80 ℃保存的菌種在LB平板劃線，于37 ℃培養(yǎng)20 h轉(zhuǎn)接到斜面，斜面保存在4 ℃。種子培養(yǎng)：從斜面挑取菌落，接種在種子培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。搖瓶發(fā)酵：將種子液按一定比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。

1.2.2 拮抗芽胞桿菌的篩選 平板共培養(yǎng)篩選，方法參照文獻(xiàn)[16]，長柄鏈格孢菌在PDA平板上活化后，用5 mm的打孔器從菌落邊緣取下新鮮菌餅，接入新鮮Waksman平板中心做指示菌，用接種環(huán)挑取分離純培養(yǎng)物在距離菌餅3 cm處劃線，每個(gè)菌株做3次重復(fù)，以僅接種病原真菌菌塊而沒有接種測(cè)試菌的作為對(duì)照。然后所有測(cè)試菌株放置在30 ℃培養(yǎng)大約 7 d，待對(duì)照平板菌落長滿后，測(cè)量空白對(duì)照病原菌接種點(diǎn)距離沿平板邊緣輻射生長的距離（R1）和接種拮抗菌時(shí)病原菌接種點(diǎn)距離沿拮抗菌方向輻射生長的距離（R2）。

病原菌徑向生長抑制率（PIRG）[17]：

PIRG＝（R1-R2）/R1×100%

R1表示空白對(duì)照組病原菌接種點(diǎn)距離沿平板邊緣輻射生長的距離；R2表示處理組病原菌接種點(diǎn)距離沿拮抗菌方向輻射生長的距離。

1.2.3 盆栽試驗(yàn) 病原菌培養(yǎng)：赤星病原菌 A.longipes ACCC 30002于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，刮下孢子，用1%葡萄糖溶液將孢子濃度調(diào)為105個(gè)/mL，備用；拮抗菌的制備：拮抗菌在種子液中培養(yǎng)，離心稀釋，調(diào)整菌株細(xì)胞濃度為109CFU/mL，備用；煙草幼苗培養(yǎng)：2011年3月煙草K326種子經(jīng)表面消毒后催芽、播種，培養(yǎng)至第 10片真葉展開，移至盆缽，盆缽置于溫室中，溫室條件為28～30 ℃，相對(duì)濕度為65%，16 h光照（白天）、8 h黑暗（晚上）；盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)：2011年7月中旬，將拮抗菌均勻噴灑在煙葉上，48 h后將 A.longipes ACCC 30002孢子液噴灑在煙葉上。從第1株煙發(fā)病時(shí)間作為起始時(shí)間，每隔5 d統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。盆栽試驗(yàn)每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株煙，每組共15株煙。CK組：不接種拮抗菌，48 h后接種病原菌；處理組：接種拮抗菌，48 h后接種病原菌。

1.2.4 生防效果評(píng)價(jià)方法 煙草赤星病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（病情代表值）：

0級(jí)：全株無病；1級(jí)：病斑面積占葉片面積的1%以下；3級(jí)：病斑面積占葉片面積的1%～5%；5級(jí)：病斑面積占葉片面積的6%～10%；7級(jí)：病斑面積占葉片面積的 11%～20%；9級(jí)：病斑面積占葉片面積的21%以上。

盆栽試驗(yàn)發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)防效：

發(fā)病率＝N/M×100%

N表示發(fā)病株數(shù)，M表示調(diào)查總株數(shù)；

病情指數(shù)＝∑（i×Ni）/（I×M）×100%

I表示病情代表值，Ni表示 i病情下發(fā)病株數(shù)目，I表示最高病情代表值，M表示調(diào)查總株數(shù)；

相對(duì)防效＝（FCK-Fm）/FCK×100%

FCK表示CK組病情指數(shù)，F(xiàn)m表示處理組病情指數(shù)。

1.2.5 菌株鑒定方法 以實(shí)驗(yàn)室保存的 B.subtilis 3-10為參照，菌株的生理生化鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第9版。Biolog微生物系統(tǒng)鑒定方法見儀器操作說明。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析方法 以上盆栽試驗(yàn)及培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行顯著差異性（P＜0.05）分析。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的篩選及鑒定

2.1.1 拮抗芽胞桿菌篩選 通過平板對(duì)峙篩選，從實(shí)驗(yàn)室保存的93株芽胞菌株中篩選出了10株拮抗效果較好的菌株。從抑菌效果看（表1），菌株K11、KN1的平均PIRG值最大，達(dá)到了63.64%和61.36%，可以作為盆栽試驗(yàn)的測(cè)試菌株。雖然菌株 1-1的PIRG值不突出，但其生長速度明顯快于其它菌株，表現(xiàn)出生態(tài)位點(diǎn)上的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，因此也可以作為盆栽試驗(yàn)的測(cè)試菌株。

2.1.2 煙草赤星病拮抗菌的溫室盆栽試驗(yàn) 由表 2和圖1可知，篩選的3株拮抗菌都具有一定的生物防治效果。發(fā)病第10天，K11菌處理組相對(duì)防效最高為51.11%，病情指數(shù)比對(duì)照下降了17.03%，并且低于KN1和1-1處理組，說明K11具備較好的生物防治效果。

表2 3株拮抗菌株對(duì)煙草赤星病生防效果Table2 Bio-control effect of three antagonistic strains against tobacco brown spot disease

圖1 接種拮抗菌后煙株病情指數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.1 The change of disease index with the treatment of antagonistic strains selected with time

2.2 菌株K11的鑒定

2.2.1 菌株 K11的形態(tài)觀察及生理生化指標(biāo) 菌株K11在LB固體培養(yǎng)基上生長，菌落培養(yǎng)初期粘稠、表面光滑、邊緣整齊，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落近白色，圓形，表面干燥、起皺、不透明。K11菌株的形態(tài)、生理生化特征（表3）與B.subtilis 3-10最為接近。

2.2.2 Biolog微生物自動(dòng)分析儀鑒定 Biolog微生物自動(dòng)分析儀鑒定微生物需要考慮3個(gè)參數(shù)：可能性、相似性（SIM）、位距（DIS）。SIM 和 DIS是兩個(gè)重要的參數(shù)，表示測(cè)試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的數(shù)據(jù)的匹配程度。當(dāng)DIS＜5.0，SIM＞0.75為良好的匹配；SIM值越接近于1%，檢定結(jié)果的可靠性越高。根據(jù)96孔板的反應(yīng)結(jié)果，系統(tǒng)顯示了10個(gè)可能的ID，如果10個(gè)SIM值的總和大于0.5時(shí)，系統(tǒng)給出的鑒定結(jié)果ID是一個(gè)屬名，菌株K11的10個(gè)ID值總和為0.635，K11屬于芽胞桿菌屬，初步鑒定為Bacillus subtilis 。

2.3 菌株K11的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 碳源的選擇 以20 g/L甘油的含碳量作為參考，選取7種常用有機(jī)碳源，以含碳量相等的原則替換甘油，考察K11的利用情況。結(jié)果如圖2所示，對(duì)K11生長的有利碳源是蔗糖、葡萄糖。考慮到葡萄糖的成本要遠(yuǎn)低于蔗糖，因此，選用葡萄糖為碳源。

表3 菌株K11的生理生化特點(diǎn)Table3 The physiological and biochemical characteristic of the strain K11

圖2 不同碳源對(duì)菌株K11生物量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on biomass production

2.3.2 氮源的選擇 以20 g/L的蛋白胨含氮量為參考，選取6種常用氮源，以含氮量相等的原則代替蛋白胨。如圖3所示，選取豆粕作為有機(jī)氮源。

2.3.3 無機(jī)鹽的篩選 如圖4所示，選用1 g/L的ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、FeSO4和 CaCO3進(jìn)行單一無機(jī)鹽替換。MgSO4·7H2O 和K2HPO4對(duì)K11的生物量有顯著性影響。

2.3.4 培養(yǎng)基主要成分正交試驗(yàn)結(jié)果 分別采用單因素實(shí)驗(yàn)考查葡萄糖（10～30 g/L）、豆粕（10～40 g/L）、MgSO4·7H2O（0.1～0.9 g/L）和 K2HPO4·3H2O（0.5～3.0 g/L）對(duì)K11生物量的影響，結(jié)果表明，各自的合適濃度為：葡萄糖20 g/L，豆粕30 g/L，K2HPO4·3H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L。其中，MgSO4·7H2O添加量在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)K11生物量沒有顯著影響。進(jìn)一步采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討葡萄糖、豆粕和K2HPO4·3H2O對(duì)K11生物量的影響（表4）。

圖3 不同氮源對(duì)菌株K11生物量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on biomass production

圖4 無機(jī)鹽對(duì)菌株K11生物量的影響Fig.4 Effect of 5 types of inorganic salt on biomass production

表4 培養(yǎng)基主要成分正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table4 The orthogonal experiment design of major component in the medium

表5 培養(yǎng)基主要成分正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 The results of orthogonal experiment of major component in the medium

從表5可知，在本次正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件下，通過Minilab軟件進(jìn)行極差分析，得出各因素影響K11生物量的主次順序?yàn)槠咸烟牵径蛊桑玖姿釟涠?。最?yōu)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20 g/L，豆粕40 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L。優(yōu)化后生防菌株 K11的生物量比對(duì)照提高6.5倍，生物量高達(dá)1.28×1010CFU/mL，芽胞形成率在95%以上。

3 討 論

本研究由病情指數(shù)與時(shí)間的變化曲線來看，菌株1-1處理組在發(fā)病初期有最低的病情指數(shù)，可能原因是該菌生長速度快，占據(jù)了煙草葉片上的生態(tài)位點(diǎn)，起到了防止病原菌侵入的作用。3株菌相比，菌株K11相對(duì)防效更加穩(wěn)定，但隨著時(shí)間推移，拮抗菌相對(duì)防治效果的整體趨勢(shì)是下降的。一方面可能隨著煙葉表面營養(yǎng)的匱乏，拮抗菌的數(shù)量隨之下降；另一方面萌發(fā)的病原菌孢子成功侵入植株后，在植株體內(nèi)存在特定的庇護(hù)場(chǎng)所而不會(huì)受到拮抗菌的影響[18]。氮源優(yōu)化的過程中，當(dāng)豆粕濃度過高時(shí)（＞30 g/L）反而不利于生物量的合成，可能是菌株K11生物量的合成需要好氧條件，而高濃度豆粕使培養(yǎng)體系過于粘稠，不利于溶氧的傳遞。

一般來講拮抗微生物能夠在葉圍及根際生存、定殖，是因?yàn)槠淠茉隗w表占據(jù)有利的空間，與病原物進(jìn)行空間及營養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)還能分泌拮抗物質(zhì)，如幾丁質(zhì)酶、抗生素、細(xì)菌毒素等，這些物質(zhì)能抑制病原菌的生存，甚至殺死病原菌，本研究篩選的芽胞桿菌K11的生防機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。芽胞桿菌作為生防菌，在應(yīng)用與生產(chǎn)過程中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[15]。

4 結(jié) 論

在所篩選的拮抗芽胞桿菌中，菌株K11的相對(duì)防效更加穩(wěn)定，接種后第10天，菌株K11對(duì)赤星病的相對(duì)防效達(dá)到最大，為51%，但隨著時(shí)間推移，拮抗菌相對(duì)防治效果呈下降趨勢(shì)。菌株K11的最優(yōu)氮源是豆粕，其最優(yōu)濃度是40 g/L，高濃度的豆粕影響溶氧，不利于菌體的生長。

芽胞桿菌的拮抗機(jī)理比較復(fù)雜，本研究篩選出的枯草芽胞桿菌K11在煙草赤星病的防治過程中存在重大應(yīng)用價(jià)值，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方對(duì)其生物菌劑的生產(chǎn)提供了重要參考，其生防機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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