黑龍江省煙草角斑病菌菌系分化研究

孫劍萍，文景芝，孫宏偉，王春軍，張 萌，郭兆奎

（1.牡丹江煙草科學研究所，黑龍江 牡丹江 157011；2.東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱 150030；3.牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157011）

煙草角斑病在世界各地均有發(fā)生，是煙草產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害之一，由丁香假單胞桿菌角斑?；?Pseudomonas syringae pv.Angulata（Fromeetal）Holland侵染引起。近些年來，由于生產(chǎn)上單一感病品種的連片種植，給煙草角斑病的流行創(chuàng)造了良好的條件，使該病害逐年加重，特別是黑龍江、遼寧等省發(fā)病最為嚴重，個別煙區(qū)發(fā)病率高達100%，已嚴重威脅部分煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的發(fā)展[1-2]。利用抗病品種是最經(jīng)濟、安全、有效的方法。而目前生產(chǎn)上的植煙品種對該病害的抗性都較差，甚至是嚴重感病[3]，又沒有安全有效的化學手段防治該病害，一旦發(fā)病，便束手無策。因此選育適合的抗病品種尤為重要，為育出具有針對性的、抗性強的廣譜抗病品種，就必須掌握當?shù)夭≡甑姆N群分布及遺傳分化情況[1,4]。筆者對黑龍江省煙草角斑病菌菌系分化現(xiàn)象進行了深入研究，以期為監(jiān)測黑龍江省角斑病菌種群動態(tài)，合理優(yōu)化品種布局、選育廣譜抗病品種及煙草角斑病的綜合防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試煙草品種包括國外引進品種，國內(nèi)外種植的品種，目前黑龍江省煙區(qū)主栽品種，以及野生鑒別寄主黃花煙（Nicotiana rustica）和長花煙（N.longiflora Cav.）共36個，見表1。

表1 供試煙草品種Table1 Tobacco cultivars used for the test

1.2 供試菌株

供試菌株于2012年采自黑龍江省15個主產(chǎn)煙區(qū)的煙草角斑病病葉，經(jīng)平板劃線法分離、多次單菌落純化并鑒定后得到 19個菌株，菌株保存在KBA斜面?zhèn)溆茫⒅糜?5%甘油溶液中，-70 ℃長期保存[5]。2013年試驗前在超凈工作臺無菌操作環(huán)境下將各菌株分別接到LB液體培養(yǎng)基中置于26 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，轉速200 r/min。再將活化后的菌株重新進行平板劃線分離和單菌落純化，作為供試菌株待接種用，各菌株見表2。

1.3 人工接種

試驗于 2013年在牡丹江煙草科學研究所試驗基地（寧安市范家鄉(xiāng)）進行。

1.3.1 田間試驗設計 將 19個供試菌株分別接種到36個供試煙草品種上。每個品種接種3株煙，每株煙接種在第8～12片葉上，并設1個對照（不接種病原菌）。重重4次，隨機區(qū)組試驗設計。

1.3.2 菌懸液的配制 將上述供試菌株轉至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)18～24 h，經(jīng)滅菌水稀釋后，配制成3×108～5×108cfu/mL菌懸液，以供接種。

1.3.3 接種方法 在煙株團棵期的第8～12片葉上，各針刺接種10個接種點，接種前2 h將試驗田全部灌水至土壤飽和狀態(tài)，增加試驗田濕度，接種后每隔2 h清水噴霧，保持試驗田濕度。

表2 供試煙草角斑病菌株來源Table2 Sources of Pseudomonas syringae pv.tabaci for test

1.4 調(diào)查、統(tǒng)計及分析方法

1.4.1 病情的調(diào)查、統(tǒng)計及分析 接種10 d后，調(diào)查發(fā)病程度，計算病情指數(shù)。采用 Statistics軟件v19.0.0版對病情指數(shù)進行方差分析，并用系統(tǒng)聚類法對36個煙草品種進行聚類分析。

1.4.2 角斑病的分級 根據(jù)黑龍江省煙草角斑病發(fā)生規(guī)律、發(fā)生程度及葉部病害的發(fā)病特點，并參考中華人民共和國煙草行業(yè)標準 YC/T341.6—2010中對煙草野火病、角斑病發(fā)生程度的分級指標，將本試驗中各煙草品種的抗感劃分標準如下，見表3。

表3 煙草角斑病的分級標準Table3 The scale of disease severity

2 結 果

2.1 煙草品種抗病性及菌種致病性差異比較

對接種后的試驗結果進行方差分析（表 4）表明，供試煙草品種間、菌株間的差異極顯著，說明供試煙草品種對煙草角斑病的抗病性表現(xiàn)以及菌株間的致病力表現(xiàn)存在顯著差異。同一煙草品種對不同菌株的抗病力不同，同一菌株對不同煙草品種的致病力也不同，證明煙草角斑病病菌存在遺傳分化現(xiàn)象。

表4 煙草角斑病病情指數(shù)方差分析Table4 Analysis of variation on disease index

2.2 煙草品種抗性的聚類分析

通過供試品種對 19個菌株病情指數(shù)的不同表現(xiàn)，將36個煙草品種分為6個類群（圖1），其中長花煙為一群（1號群）；黃花煙為一群（2號群）；Cui-1為一群（3號群）；NC89、G80、LJ935和LJ237為一群（4號群）；Coker411和B-21為一群（5號群）；Yunyan87、Coker176、LJ911、K346、K326、小花青、G28、9833-514、NC82、YH-02、Yunyan97、中煙 100、LJ925、JY-02、LJ912、Nanka58、8304-1、長脖黃、大青筋、Hongda、CF80、TL106、9861-81、KY14、LJ851、Yunyan85和NC95為一群（6號群）。

2.3 煙草角斑病菌鑒別寄主的選擇

圖1 36個煙草品種的聚類圖Fig.1 Clustering of 36 tobacco cultivars

建立一套合理的鑒別寄主體系需要有抗感表現(xiàn)穩(wěn)定、抗感類型豐富、來自主產(chǎn)煙區(qū)的代表品種。根據(jù)這一原則及上述差異性分析及聚類分析結果，從 36個供試煙草品種中篩選出具有較好鑒別能力的 5個品種作為黑龍江省煙草角斑病菌的鑒別寄主。1號群中的長花煙作為高抗品種；在4號群中選出的G80作為中抗代表品種；在5號群中選出的Coker411作為抗病代表品種；3號群中的Cui-1作為中感品種；在6號群中選出的Yunyan 97作為高感代表品種。

2.4 煙草角斑病菌生理小種的劃分

用長花煙（A）、G80（B）、Coker411（C）、Cui-1（D）、Yunyan 97（E）作為煙草角斑病的鑒別寄主，根據(jù)角斑病等級劃分標準（表3），將所有供試菌株劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等5個生理小種（表5）。

表5 供試菌株的生理小種組成Table5 The identification of physiological race of Pseudomonas syringae pv.Tabaci

3 討 論

目前國內(nèi)外對煙草角斑病菌生理小種遺傳分化現(xiàn)象的研究還未見報道，煙草角斑病菌生理小種的劃分在國際上還是空白[6]。本研究是采集19個煙草角斑病菌菌株，通過其對 36個供試煙草品種致病力重復表現(xiàn)差異進行聚類分析所得出的結論，能較為真實的反映黑龍江省煙草角斑病菌的致病力分化。但對病害生理小種的劃分需要大量的病原菌進行多次重復試驗，因此還需繼續(xù)擴大菌株數(shù)量進行多次重復驗證。

本試驗采集的 19個煙草角斑病菌菌株來自黑龍江省 15個烤煙產(chǎn)區(qū)，其中有同一個產(chǎn)區(qū)的角斑病菌菌株被劃分為同一個生理小種，也有同一個產(chǎn)區(qū)的角斑病菌菌株被劃分為不同的生理小種，這種現(xiàn)象在自然界植物與病原菌的互作中普遍存在，病原菌的繁殖速度快，個體微小，與外界環(huán)境的接觸面積大，可在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的變異后代，并且容易受到環(huán)境條件的影響而發(fā)生變異。寄主植物和病原物在自然界中能夠長期共存，得益于兩者之間不斷的相互選擇和相互適應而協(xié)同進化，正是這種協(xié)同進化產(chǎn)生了寄主植物的抗病性不同和病原物的致病力不同，進而產(chǎn)生了病原物株系的分化，同一煙區(qū)的烤煙和角斑病菌之間的協(xié)同進化速率不同，而產(chǎn)生了不同致病力的角斑病菌，因此同一煙區(qū)采集來的角斑病菌被劃分為不同的生理小種是有可能存在的。近幾年，黑龍江省正逐步更換烤煙品種，再加上面積較大的煙區(qū)有著不同的氣候條件和土壤條件，也進一步導致了角斑病菌的生理小種在同一煙區(qū)出現(xiàn)了分化。本試驗旨在明確黑龍江省煙草角斑病菌的生理小種分化，因此在省內(nèi)的同一煙區(qū)采集的角斑病菌較少，要想明確一個煙區(qū)的病原菌的生理小種組成，還需在這個煙區(qū)大量采集病原菌，選擇合適的鑒別寄主，進行詳細的生理小種鑒定試驗，這是筆者下一步的工作。

當前，在多種作物的病原菌生理小種鑒定上，已使用單基因抗病品種（系）作為鑒別寄主[7]，而在煙草上采用這樣的鑒別寄主鑒定煙草角斑病生理小種，尚需明確鑒別寄主中的角斑病抗性基因。目前全球第一套煙草全基因組序列圖譜——絨毛狀煙草和林煙草全基因組序列圖譜已完成，將為煙草抗病基因的定位﹑克隆創(chuàng)造條件，為進一步采用分子生物學技術對煙草角斑病菌生理小種的遺傳多樣性分析創(chuàng)造條件。

4 結 論

試驗分析結果顯示，黑龍江省煙草角斑病菌與烤煙品種的致病力和抗病力間存在顯著差異，說明煙草角斑病菌存在遺傳分化現(xiàn)象。

通過對來自不同產(chǎn)區(qū)采集的 19個煙草角斑病菌菌株與 36個供試煙草品種致病力的差異性分析和聚類分析，按照鑒別寄主體系的建立標準選出長花煙作為鑒別寄主體系中的高抗品種、G80作為中抗代表品種、Coker411作為抗病代表品種、Cui-1作為中感品種、Yunyan 97作為高感代表品種組成的鑒別寄主體系，將供試的 19個煙草角斑病菌菌株劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等5個生理小種。

[1]孫劍萍，孫宏偉.黑龍江省煙草野火病菌生理小種鑒別寄主的篩選[J].煙草科技，2011（10）：75-77.

[2]河南農(nóng)業(yè)大學，云南農(nóng)業(yè)大學.煙草病理學教程[M].北京：中國科學技術出版社，1995.

[3]張世珖，陳惠明.11個煙草品種對煙草病菌的抗性鑒定[J].煙草科技，1989（1）：29-31.

[4]彭潤，張世珖.云南煙草野火病生理小種分化的研究[J].植物病理學報，2005，35（1）：1-5.

[5]劉雅婷.云南煙草野火病的發(fā)生規(guī)律研究(I)[D].昆明：云南農(nóng)業(yè)大學，2001.

[6]Woodend J J, Mudzengerere E.Inheritance of resistance to wildfire and angular leaf spot derived from Nicotiana rustica Var[J].brasilea Euphytica, 1992, 64(1-2)∶149-156.

[7]佟道儒.煙草育種學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：453-457.