烤煙碳氮代謝關鍵酶活性動態(tài)及其與類胡蘿卜素關系研究

楊志曉，史躍偉，林世峰，王志紅，謝升東，任學良*

（貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081）

近年來，我國煙葉生產(chǎn)水平大幅提升，煙葉生長的整齊度和烤后煙葉質(zhì)量的均衡性大大提高[1]；但與國外優(yōu)質(zhì)烤煙相比，香氣質(zhì)差、香氣量不足、化學成分不夠協(xié)調(diào)仍是影響我國煙葉質(zhì)量提高的制約性因素[2]。相關研究指出，碳氮代謝是烤煙體內(nèi)最基本的代謝過程，碳氮代謝活動的強度、協(xié)調(diào)程度及其在煙葉生長和成熟過程中的動態(tài)變化模式直接或間接影響煙葉中各類化學成分的含量和組成比例，對煙葉品質(zhì)產(chǎn)生重大影響；煙葉碳氮代謝失調(diào)，煙葉香氣質(zhì)差、香氣量不足，煙葉質(zhì)量難以提高[3-4]。類胡蘿卜素是煙葉中重要的致香前體物質(zhì)，烤后煙葉類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物含量和協(xié)調(diào)性，直接影響烤煙的香氣風格、香氣質(zhì)和香氣量[5-6]。目前，關于烤煙碳氮代謝與類胡蘿卜素之間關系的研究報道還較少，而在煙葉碳氮代謝過程中，各種酶的活性變化起著決定性的調(diào)節(jié)作用[7]。因此，本研究以不同基因型烤煙品種 K326、紅花大金元為材料，研究了碳氮代謝關鍵酶的動態(tài)變化及其與類胡蘿卜素之間的相關關系，以期為特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)和高香氣、低危害烤煙品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于 2010年在貴州省貴定縣進行。以我國主栽烤煙品種紅花大金元、K326為試驗材料，供試土壤類型為黃壤土，肥力中等，地面平坦向陽，排水良好。

1.2 試驗設計

試驗采用大區(qū)種植，每個品種各種植0.33 hm2。于2010年4月28日移栽，行距110 cm，株距50 cm。施氮量為 90 kg/hm2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶0.8∶2.5。移栽后55 d時現(xiàn)蕾初花打頂，每株留葉數(shù)為18片，其他田間管理按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術方法進行。選取每個品種的中部葉（從下向上數(shù)第10～12片葉）作為待測樣品，取樣時間分別為移栽后30、45、60、75、90 d。鮮樣取下后立即用液氮冷凍帶回，存于-80℃冰箱待用。

1.3 測定內(nèi)容與方法

1.3.1 碳氮代謝關鍵酶活性測定 硝酸還原酶活性測定按照活體法進行[8]，谷氨酰胺合成酶活性測定按照分光光度法進行[9]，淀粉酶活性測定按照3,5-二硝基水楊酸比色法進行[10]，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性測定按照3,5-二硝基水楊酸比色法進行[11]，每項測定指標重復3次。

1.3.2 類胡蘿卜素含量測定 采用反相高效液相色譜法測定[12]。準確稱取0.200 g樣品，放入25 mL試管中，加入25 mL90%（體積分數(shù)）的丙酮，室溫下超聲萃取20 min。取約1 mL萃取液，用0.45 μm微膜過濾器過濾，濾液裝入棕色色譜瓶中進行HPLC分析，分析條件為：色譜柱 Waters Nova-Pak-C18（3.9×150 mm，4 μm）；柱溫 30 ℃；檢測波長450 nm。流動相A，異丙醇B，乙腈+水（體積比 80∶20）；梯度洗脫：100%B（0 min）→100%A（40 min）；柱流速0.5 mL/min；平衡時間6 min；進樣量10 μL。采用比較標樣保留時間法定性，外標法定量。

1.3.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 不同基因型烤煙氮代謝關鍵酶活性變化

2.1.1 硝酸還原酶 從圖1可以看出，不同基因型烤煙品種 K326、紅花大金元葉片硝酸還原酶活性變化趨勢基本一致：在移栽后隨著生育進程的推移，硝酸還原酶活性呈增加趨勢，在移栽后60 d時達到最大值，此后迅速下降。這表明生長前期煙株氮代謝旺盛，對氮素的吸收、同化利用能力較強，有利于滿足煙株的生長發(fā)育，進入成熟期后硝酸還原酶活性下降，能夠促進煙葉正常落黃成熟和內(nèi)在品質(zhì)的形成。同時，結果表明，在生長發(fā)育過程中，不同基因型烤煙品種葉片硝酸還原酶活性存在差異，在各個生育期均表現(xiàn)為紅花大金元>K326，表明紅花大金元的氮代謝能力較強。

圖1 不同基因型烤煙硝酸還原酶活性變化Fig.1 Activity change of nitrate reductase in different flue-cured tobacco cultivars

2.1.2 谷氨酰胺合成酶 圖2表明，整體上兩個不同基因型烤煙品種葉片谷氨酰胺合成酶活性在生育期內(nèi)的變化趨勢相同，即呈單峰曲線變化，在移栽后60 d時活性達到最大值，之后下降。在煙葉成熟期，谷氨酰胺合成酶活性較低，表明這個時期煙葉中氨同化代謝活動已非常微弱。就不同烤煙品種而言，在整個生育期內(nèi)，紅花大金元谷氨酰胺合成酶活性均高于 K326，表明紅花大金元氨同化能力優(yōu)于K326。

圖2 不同基因型烤煙谷氨酰胺合成酶活性變化Fig.2 Activity change of glutamine synthetase in different flue-cured tobacco cultivars

2.2 不同基因型烤煙碳代謝關鍵酶活性變化

2.2.1 蔗糖轉(zhuǎn)化酶 圖3為不同基因型烤煙葉片蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化，結果顯示，整個生育期內(nèi)，不同基因型烤煙品種蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性變化趨勢一致，移栽后30～60 d時，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較低，呈緩慢增加趨勢；此后，迅速上升，在75 d時達到最大值，然后活性下降。這表明在葉片功能盛期，碳代謝活性較弱，主要以氮代謝為主；進入葉片功能盛期，氮代謝減弱，以碳代謝為主。蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高，能夠促進光合產(chǎn)物的合理分配，有利于形成優(yōu)質(zhì)煙葉。不同基因型間比較結果表明，紅花大金元葉片蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性高于 K326，表明紅花大金元對有機碳的固定能力較強。

圖3 不同基因型烤煙蔗移糖栽轉(zhuǎn)后化天數(shù)酶/d活性變化Fig.3 Activity change of invertase in different flue-cured tobacco cultivars

2.2.2 淀粉酶 從圖4可以看出，在移栽后30～45 d，煙葉淀粉酶活性處于較低的水平，隨著葉片的生長發(fā)育和進入現(xiàn)蕾期，淀粉酶活性迅速升高，在移栽后60 d時達到最大值，之后淀粉酶活性逐漸降低。表明在生長前期淀粉在逐漸積累，但積累量較?。滑F(xiàn)蕾期淀粉積累迅速增多，進入成熟期后淀粉由積累向分解轉(zhuǎn)化。就不同基因型間而言，紅花大金元葉片淀粉酶活性在整個生育期內(nèi)均高于K326，說明紅花大金元葉片積累淀粉的能力較強，葉片淀粉含量較高。

圖4 不同基因型烤煙淀粉酶活性變化Fig.4 Activity change of amylase in different flue-cured tobacco cultivars

2.3 不同基因型烤煙類胡蘿卜素含量變化

煙葉類胡蘿卜素主要由 β-類胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)組成，對煙葉香氣貢獻率大[13]。從表1可以看出，隨著生育進程的推移，類胡蘿卜素各組分含量均呈下降趨勢。β-類胡蘿卜素含量在前期降解速度較慢，在移栽60 d后下降明顯。新黃質(zhì)在30～45 d時迅速下降，而后，降解速度較慢，進入成熟期，又呈明顯下降趨勢。紫黃質(zhì)含量在前期下降明顯，中后期呈緩慢下降趨勢。葉黃素在前期降幅較小，進入成熟期后快速下降。類胡蘿卜素各組分中以 β-類胡蘿卜素含量最高，其次為葉黃素，新黃質(zhì)含量較低，而紫黃質(zhì)含量最少。同時，結果表明，在整個生育期內(nèi)，不同基因型烤煙品種類胡蘿卜素含量存在差異，β-類胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)均以紅花大金元含量較高。紅花大金元煙葉中類胡蘿卜素含量較高，表明煙葉類胡蘿卜素含量與基因型表現(xiàn)有關。

表1 不同基因型烤煙類胡蘿卜素含量變化 μg/gTable.1 Content change of carotenoids in different flue-cured tobacco cultivars

2.4 類胡蘿卜素含量與碳氮代謝關鍵酶活性的相關分析

相關分析結果表明（表2），類胡蘿卜素各組分間均呈極顯著（P<0.01）正相關關系。β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)與硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、淀粉酶活性均呈負相關關系，但相關關系不顯著（P>0.05），但β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)均與蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性呈顯著負相關關系（P<0.05），表明蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性較高不利于煙葉生長發(fā)育過程中類胡蘿卜素的合成、積累。

表2 烤煙類胡蘿卜素含量與碳氮代謝關鍵酶活性的簡單相關系數(shù)Table2 Pearson correlation coefficients between carotenoids contents and key enzyme activities involved in carbon and nitrogen metabolism

注: *表示0.05顯著水平，**表示0.01極顯著水平。

3 討 論

試驗結果表明，在煙草生長發(fā)育過程中，氮代謝關鍵酶硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和碳代謝關鍵酶蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶變化規(guī)律基本一致，即四種酶活性在葉片功能盛期均呈增加趨勢，進入成熟期，硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶活性迅速下降，而蔗糖轉(zhuǎn)化酶、淀粉酶在達到峰值后也呈下降趨勢，但降幅較小，葉片以碳代謝活動為主。這與以往的研究結論基本一致[14]。同時，研究表明，不同基因型烤煙品種間葉片碳氮代謝關鍵酶活性也存在明顯差異，紅花大金元葉片硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶以及淀粉酶活性全生育期均高于 K326，說明紅花大金元碳氮代謝活動旺盛，這可能是紅花大金元內(nèi)在品質(zhì)良好的重要原因。

類胡蘿卜素是煙草香氣的重要前體物，與香氣量、香氣質(zhì)成正相關關系[15]。本文研究發(fā)現(xiàn)，在生長發(fā)育過程中，紅花大金元葉片中類胡蘿卜素各組分β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)含量均高于 K326，這與楊紅旗、張樹堂的研究結果相一致[16-17]。在同一生態(tài)條件和種植管理方式下，紅花大金元葉片中類胡蘿卜素含量較高，這可能是紅花大金元煙葉香氣質(zhì)好的原因之一。過偉民研究了我國六個主栽品種的類胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)不同品種葉片類胡蘿卜含量存在明顯差異，中煙100中部葉片中紫黃質(zhì)、葉黃素、β-類胡蘿卜素和總類胡蘿卜素含量均顯著高于其它品種[18]。這與本文結果相似，表明煙葉中類胡蘿卜素含量存在基因型差異；基因型不同，煙株對類胡蘿卜素的合成和降解能力不同，導致葉片內(nèi)類胡蘿卜素各組分含量存在差異。品種是決定烤煙中類胡蘿卜素合成、積累的的首要因素，因此，可以通過育種途徑選育類胡蘿卜素含量適宜的烤煙品種，從而提高煙葉品質(zhì)。

由類胡蘿卜素各組分含量與碳氮代謝關鍵酶相關分析結果可知，類胡蘿卜素各組分與硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶呈負相關關系，但相關性未達到顯著水平，表明硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和淀粉酶對煙葉類胡蘿卜素含量影響不大。而β-類胡蘿卜素、新黃質(zhì)、葉黃素和紫黃質(zhì)均與蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性呈顯著負相關關系，說明類胡蘿卜素在生長發(fā)育過程中的變化與碳氮代謝關鍵酶有一定的關聯(lián)性。蔗糖轉(zhuǎn)化酶對煙葉類胡蘿卜素合成、積累影響較大，可以通過調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性改善煙葉類胡蘿卜素含量，從而達到提高煙葉品質(zhì)的目的。

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