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    16個線粒體DNA SNP復合檢測體系的建立

    2014-05-21 03:12:36聶燕釵周懷谷
    法醫(yī)學雜志 2014年1期
    關鍵詞:法醫(yī)等位基因分型

    吳 丹 ,聶燕釵 ,曹 禹 ,曹 淵 ,周懷谷

    (1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學現(xiàn)場應用技術公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室,上海 200083;2.復旦大學上海醫(yī)學院,上海 200032;3.無錫中德美聯(lián)生物技術有限公司,江蘇 無錫 214174)

    人類線粒體DNA(mtDNA)是位于細胞核以外的唯一基因組DNA,具有突變率高、遵循母系遺傳的特點,與每個體細胞核DNA只有兩個拷貝相比,其mtDNA則有成百上千個拷貝,因此,對那些因微量、降解、腐敗等原因而造成核DNA分型失敗的生物檢材進行mtDNA檢測分析成為法醫(yī)物證領域又一重要的技術手段[1]。同時,在母系親緣關系認定、大型災難調查、考古研究等方面,mtDNA檢測分析也顯示出良好的應用前景。目前常規(guī)的mtDNA檢測方法仍然是對其高變區(qū)的直接測序,存在步驟繁瑣、費時費力、測序區(qū)段有限等缺陷,大大影響了mtDNA在法醫(yī)物證領域的研究和應用。

    本研究利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)遺傳標記分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、分析片段短、可實現(xiàn)高通量、自動化檢測等特點[2],結合等位基因特異性引物擴增和毛細管電泳檢測,開發(fā)建立一種16個mtDNA SNP的復合檢測體系,對mtDNA進行簡便、有效的高通量分型提供一種新的技術手段。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    50份漢族無關個體FTA卡血液樣本,通風干燥處保存。

    1.2 主要儀器與試劑

    QIAcube多功能全自動樣本制備工作站(德國QIAGEN公司),9700型PCR擴增儀(美國AB公司),7500實時熒光PCR儀(美國AB公司),3130XL遺傳分析儀(美國AB公司),Quantifiler DNA定量試劑盒(美國 AB 公司),Wizard?DNA Clean-up System(美國 Promega公司),BigDye Terminator Cycle Sequencing試劑盒(美國AB公司)。

    1.3 提取DNA與定量分析

    應用QIAcube多功能全自動樣本制備工作站提取FTA卡血樣DNA,詳見使用說明。所得DNA采用Quantifiler DNA定量試劑盒,7500實時熒光PCR儀和SDS v1.2.3軟件進行定量分析。

    1.4 SNP位點的選擇

    參考文獻[3]并綜合考慮高變異率、引物設計、Tm值等諸多因素,最終確定亞洲人群中多態(tài)性較高的16個SNP,并以其在mtDNA的序列位置命名,即分別為:152、709、3010、3970、5178、8414、9 bp、9540、10398、10873、12705、13928、14783、15043、16311、16362,其中8281~8289位置堿基序列為CCCCCTCTA,與前面8272~8280的9個堿基形成重復,有時整體缺失,以其序列重復或缺失分別標記為NORM或DEL。

    1.5 引物的設計與合成

    等位基因特異性引物的設計:針對每個SNP標記,設計3條引物,2條上游等位基因特異性引物序列3′末端分別與二態(tài)SNP的兩種分型相對應;為限制非特異性延伸,在近其3′端倒數(shù)第3或第4位引入一個錯配堿基,兩條引物在長度上相差4 bp,以示區(qū)分;下游為公用引物,并用FAM熒光標記。

    測序引物:以300~400bp測序長度為標準,設計14對測序引物,測序片段覆蓋全部16個mtDNA SNP標記。

    引物設計采用Premier 5.0和Oliog 6.0軟件完成,由上海Sangon公司合成。

    1.6 復合擴增體系的建立

    參照理論Tm值,通過引物濃度配比調整和優(yōu)化擴增條件等手段,最終確定復合擴增體系為10μL,包括反應混合液 4μL,引物 2μL,C-Taq(5U/μL) 0.2μL,模板DNA 2μL,補純水至10μL。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃ 3min;94℃ 1min,58℃ 1min,72℃ 1min,30 個循環(huán);72℃ 20min。

    1.7 毛細管電泳分型檢測

    電泳分析,取PCR產物1μL,mtSNP等位基因分形標準物1μL,分別與AGCU Marker SIZ-500 0.5μL和去離子甲酰胺12 μL混合,95℃變性3 min,冰浴3min,電泳檢測。

    1.8 測序驗證

    采用直接測序法進行驗證。設計測序引物,隨機抽取5個樣本,對16個SNP位點序列分別進行DNA測序。對獲得的16個SNP位點上的對應堿基,與等位基因特異性引物擴增結果進行比較確認。

    2 結 果

    2.1 16個mtDNA SNP的復合擴增和分型

    采用等位基因特異性引物法,對50份無關個體樣本DNA進行復合擴增,9947A作為陽性對照。經毛細管電泳后,50個樣本均得到清晰的分型圖譜(圖1)。

    圖1 一個體mtDNA SNP復合擴增毛細管電泳圖譜

    2.2 靈敏度檢測

    采用本檢測體系,樣本DNA經倍比稀釋后,分別進行擴增檢測。結果顯示本復合擴增體系中,最低檢測量為0.1pg,當模板量在0.5~10pg時能得到較理想的分型圖譜。

    2.3 測序驗證結果

    建立的復合檢測體系檢測結果與直接測序法結果一致(圖 2)。

    圖2 直接測序法圖譜(9bp序列重復)

    3 討 論

    SNP是由基因組水平上的單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最能反映群體遺傳結構和個體間遺傳差異的遺傳標記之一。目前已開發(fā)的SNP檢測方法如利用熒光淬滅效應和實時熒光檢測的TaqMan技術,檢材適應性廣、穩(wěn)定性好,但成本高、探針設計難度高[4];基于引物延伸原理的SNPShot微測序方法,結果穩(wěn)定可靠,現(xiàn)在應用較多,但是仍然需要進行兩步擴增反應[5];高通量的檢測方法有等位基因特異性連接技術(SNPlex)[6]、基因芯片技術[7]以及基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)等,這些技術在應用上仍有諸多缺陷,如需要大型專用設備、花費成本過高、耗時長等,不易在一般實驗室普及。

    相比較之下,本研究建立的片段差異等位基因特異性引物法,操作簡便,DNA樣本經一步擴增后,直接用于毛細管電泳分型檢測,在現(xiàn)有的法醫(yī)實驗室平臺上就能完成整個檢驗過程,耗時短。在特異性引物設計中,在其3′端區(qū)域引入一個錯配堿基,大大提高了引物延伸的特異性,降低了SNP分析的假陽性率[8]。在本檢測體系的16個mtDNA SNP位點上,復合檢測體系檢出結果與直接測序法結果完全一致,證明該方法分型結果準確可靠。

    與直接測序法檢測的僅是線粒體高變區(qū)不同,本研究引入了13個編碼區(qū)SNP位點,由于編碼區(qū)承受的選擇壓力相對較大,堿基突變率低,分析編碼區(qū)的多態(tài)性位點無疑對法醫(yī)提高排除率起到積極作用[9]。

    在建立的10 μL PCR復合擴增體系中,最低檢測量為0.1 pg細胞總DNA,當模板量在0.5~10 pg時能得到較理想結果,與商業(yè)化的STR檢測試劑盒相比較,由于mtDNA的遺傳特性,本檢測體系顯示出更高的靈敏度。

    綜上所述,本復合檢測體系操作簡便、靈敏度高、重復性好、分型準確,可作為替代線粒體測序方法應用于法庭科學檢驗,同時為法醫(yī)微量、降解、無核檢材的高通量分型提供了新的技術手段。在后續(xù)研究中,將進一步擴大檢測樣本,并通過群體遺傳學調查,探討其在法庭科學領域的應用價值。

    [1]Parson W,Bandelt HJ.Extended guidelines for mtDNA typing of population data in forensic science[J].Forensic Sci Int Genet,2007,1(1):13-19.

    [2]Sanchez JJ,B覬rsting C,Hallenberg C,et al.Multiplex PCR and minisequencing of SNPs--a model with 35 Y chromosome SNPs[J].Forensic Sci Int,2003,137(1):74-84.

    [3]mtDB-Human Mitochondrial Genome Database[DB/OL].(2007-03-01) [2013-06-19].http://www.mtdb.igp.uu.se/.

    [4]張素華,李莉,李成濤,等.TaqMan探針技術用于X-SNP位點的分型[J].法醫(yī)學雜志,2010,26(1):22-25.

    [5]Pastinen T,Kurg A,Metspalu A,et al.Minisequencing:a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays[J].Genome Res,1997,7(6):606-614.

    [6]Tobler AR,Short S,Andersen MR,et al.The SNPlex genotyping system:a flexible and scalable platform for SNP genotyping[J].J Biomol Tech,2005,16(4):398-406.

    [7]Bogus M,Sobrino B,Bender K,et al.Rapid microarray-based typing of forensic SNPs[J].International Congress Series,2006,1288:37-39.

    [8]卜瑩,古卓良,張曉丹,等.四引物PCR擴增反應的單管SNP快速測定法[J].中國生物化學與分子生物學報,2004,20(2):252-256.

    [9]Nilsson M,Andréasson-Jansson H,Ingman M,et al.Evaluation of mitochondrial DNA coding region assays for increased discrimination in forensic analysis[J].Forensic Sci Int Genet,2008,2(1):1-8.

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