黃芩苷對急、慢性肝損傷模型鼠的保護作用

劉曉君，楊潔芳（重慶市第九人民醫(yī)院，重慶 400700）

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為多年生草本植物，別名山茶根、土金茶根，是唇形科黃芩屬的一種植物，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎、降血壓之功效，臨床用于濕溫、暑溫致胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽等證的治療[1]。黃芩中的主要成分為黃酮類化合物，其中主要黃酮類成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩新素和千層紙素A等[2]。研究表明，黃芩苷不但具有清除自由基、抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常等作用，而且還有抗肺炎衣原體所致的動脈粥樣硬化作用，對缺血再灌注損傷模型動物的大腦和心肌具有保護作用，對不同原因引起的肝損傷具有保護作用，能明顯促進成纖維細(xì)胞增殖，在體外對某些寄生蟲均有明顯的抑制和殺滅作用[3-5]。黃芩苷對急、慢性肝損傷的保護作用報道較少，故本研究ip CCl4以復(fù)制小鼠急性肝損傷模型、ip硫代乙酰胺（TAA）以復(fù)制大鼠慢性肝損傷模型來研究黃芩苷對急、慢性肝損傷模型鼠的保護作用，為臨床應(yīng)用提供理倫依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

722型分光光度計（江蘇科達(dá)智能儀器廠）；TDL80-ZB型飛鴿牌離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DY89-1型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；YP6000型電子天平（上海精科實業(yè)有限公司）；CX21型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷（西安綠立生物工程技術(shù)有限公司，批號:20120713，質(zhì)量分?jǐn)?shù):95%）；TAA（上海士鋒生物科技有限公司，批號:20110927）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物

清潔級KM小鼠（體質(zhì)量20～22 g）及SD大鼠（體質(zhì)量200～220 g），♀♂兼半，均購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所[實驗動物使用許可證號:SCXK（渝）2012-0006]。

2 方法

2.1 小鼠急性肝損傷模型的復(fù)制與分組、給藥

ip 10%CCl4橄欖油溶液0.2ml/100 g以復(fù)制小鼠急性肝損傷模型（正常對照小鼠ip等容橄欖油）。50只KM小鼠隨機均分為5組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組與黃芩苷高、中、低劑量（1.00、0.50、0.25 g/kg）組，ig給藥，每天1次，連續(xù)6 d，末次給藥12h后復(fù)制模型。

2.2 大鼠慢性肝損傷模型的復(fù)制與分組、給藥

ip TAA（200mg/kg），每周2次，連續(xù)12周，以復(fù)制大鼠慢性肝損傷模型。50只SD大鼠隨機均分為5組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組與黃芩苷高、中、低劑量（0.8、0.4、0.2 g/kg）組，復(fù)制模型的同時ig給藥，每天1次，連續(xù)12周。

2.3 指標(biāo)的測定

急性肝損傷模型小鼠復(fù)制成功48 h后，慢性肝損傷模型大鼠末次給藥24h后，摘除眼球取血，處死鼠，制備血清；取適量肝組織用冰生理鹽水沖洗后制備成10%的肝組織勻漿，測定血清及肝勻漿中ALT活性。

2.4 病理學(xué)觀察

肝組織切片，經(jīng)HE染色，光鏡下觀察肝細(xì)胞損傷程度，參照文獻(xiàn)[6]纖維化標(biāo)準(zhǔn)給鼠組織病理學(xué)評級。（1）炎性細(xì)胞浸潤:（－）無；（+）平均10個高倍視野見炎性細(xì)胞浸潤灶≤5個；（++）平均10個高倍視野見炎性細(xì)胞浸潤灶＞5個，且＜10個；（+++）平均10個高倍視野見炎性細(xì)胞浸潤灶≥10個。（2）肝細(xì)胞變性:（－）無；（+）平均10個高倍視野見少數(shù)氣球樣或彌散顆粒變性≤5個；（++）平均10個高倍視野見氣球樣變＞5個，且＜10個；（+++）平均10個高倍視野見氣球樣變≥10個。（3）肝細(xì)胞壞死:（－）無；（+）平均10個高倍視野見點狀壞死灶≤5個；（++）平均10個高倍視野見點狀壞死灶＞5個，且＜10個；（+++）平均10個高倍視野見點狀壞死灶≥10個或見灶狀壞死。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT活性增強，肝組織勻漿ALT活性減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷高、中、低劑量組小鼠血清ALT活性減弱，肝組織勻漿ALT活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響見表1。

表1 黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響（）Tab 1 Effects of baicalin on the activity of ALT in serum and liver homogenate of acute liver injury mice（）

表1 黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響（）Tab 1 Effects of baicalin on the activity of ALT in serum and liver homogenate of acute liver injury mice（）

與正常對照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組肝組織勻漿15638.48±1429.611427.53±186.67＊13426.28±1107.92##10573.46±972.37##6872.24±785.49##劑量，g/kg n 1.000.500.251010101010 ALT，U/L血清50.13±10.45229.65±41.59＊78.47±18.38##127.52±25.76##162.81±36.42#

3.2 黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT活性增強，肝組織勻漿ALT活性減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷高、中、低劑量組大鼠血清ALT活性減弱，肝組織勻漿ALT活性增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響見表2。

表2 黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響（）Tab2 Effects of baicalin on the activity of ALT in serum and liver homogenate of chronic liver injury rats（）

表2 黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠血清與肝組織勻漿ALT活性的影響（）Tab2 Effects of baicalin on the activity of ALT in serum and liver homogenate of chronic liver injury rats（）

與正常對照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組肝組織勻漿20347.64±1872.352518.52±225.47＊16279.16±1256.43##11349.55±1463.21##8035.82±941.76##劑量，g/kg n 0.80.40.21010101010 ALT，U/L血清84.52±12.61382.13±48.76＊137.39±25.84##185.27±37.51##266.45±45.26#

3.3 黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠肝組織病理學(xué)評級的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞變性、肝細(xì)胞壞死程度加重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷高、中、低劑量組小鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞變性、肝細(xì)胞壞死程度改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠肝組織病理學(xué)評級的影響見表3。

表3 黃芩苷對急性肝損傷模型小鼠肝組織病理學(xué)評級的影響Tab 3 Effects of baicalin on pathological scale of acute liver injury mice

3.4 黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠肝組織病理學(xué)評級的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞變性、肝細(xì)胞壞死程度加重，肝組織明顯損傷，肝細(xì)胞濁腫、氣球樣變性，病變以肝小葉中央靜脈周圍為重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷高、中、低劑量組大鼠肝組織也有不同程度的肝細(xì)胞破壞、炎性細(xì)胞浸潤等肝損傷病變，但病變程度改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠肝組織病理學(xué)評級的影響見表4。

表4 黃芩苷對慢性肝損傷模型大鼠肝組織病理學(xué)評級的影響Tab 4 Effects of baicalin on pathological scale of chronic liver injury rats

4 討論

CCl4、TAA誘發(fā)的化學(xué)性肝損傷是目前國際上常用的急、慢性肝炎模型，可引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化、膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死[7-8]。本研究中ip CCl4、TAA以復(fù)制急、慢性肝損傷模型，病理表現(xiàn)為實驗鼠部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞普遍濁腫，索狀排列紊亂，出現(xiàn)以中央靜脈為中心的局灶性肝細(xì)胞變性、壞死或細(xì)胞核固縮溶解，大量炎細(xì)胞浸潤；高、中、低劑量黃芩苷可明顯改善該癥狀，證明其具有肝保護作用。

ALT與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）主要分布在肝臟細(xì)胞內(nèi)，如果肝細(xì)胞壞死，ALT和AST就會升高。其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標(biāo)。這兩種酶在肝細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的，ALT主要分布在肝細(xì)胞漿，AST主要分布在肝細(xì)胞漿和肝細(xì)胞的線粒體中。因此，不同類型的肝炎患者的ALT和AST升高的程度及其AST/ALT的比值是不一樣的。急性肝炎和慢性肝炎，雖有肝細(xì)胞的損傷，但肝細(xì)胞的線粒體仍保持完整，故釋放入血的只有存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的ALT。所以，肝功能主要表現(xiàn)為ALT的升高，故本研究只選用ALT作為酶指數(shù)。ALT能敏感地反映肝細(xì)胞損傷與否及損傷程度，因為肝臟中ALT的濃度比血中高1000～5000倍，當(dāng)肝細(xì)胞破壞、細(xì)胞通透性增高及線粒體損傷時，高濃度ALT向血中釋放，血清ALT活性增強，并且ALT活性的高低變化與肝細(xì)胞受損的程度相一致[9-10]。ig黃芩苷后可明顯抑制模型鼠血清ALT活性的增強，說明黃芩苷能增強肝細(xì)胞抗損傷能力，增加膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對肝臟有一定的保護作用。

綜上所述，黃芩苷可改善急、慢性肝損傷模型鼠肝組織病理狀態(tài)，減弱其血清ALT活性，增強其肝組織勻漿ALT活性，從而起到保護肝臟的作用。

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