RP-HPLC法同時測定人血漿中馬錢子4種生物堿的含量

翁德新，戴其昌（1.德清縣第三人民醫(yī)院藥劑科，浙江 德清 31300；.湖州市食品藥品檢驗所，浙江 湖州 313000）

馬錢子，也稱番木鱉，為馬錢科植物馬錢Strychnos nuxvomica L.或云南馬錢S.pierriana A.W.Hill的干燥成熟種子，其味苦、性寒、有大毒，在中醫(yī)藥臨床上用于通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論證明，馬錢子具有抗腫瘤作用[1]。馬錢子中的各種生物堿是馬錢子的主要有效部位，其中番木鱉堿（Strychnine）、馬錢子堿（Brucine）、番木鱉堿氮氧化物（Strychnine N-oxide）和馬錢子堿氮氧化物（Brucine N-oxide）是較為重要的生物堿[2-4]。馬錢子的體內(nèi)分析研究較少，通常是單一成分檢測或兩種成分一起檢測[5]，目前未見4種成分一起檢測的方法。本研究建立了同時檢測人血漿中馬錢子4種生物堿類成分含量的方法，以為馬錢子的體內(nèi)藥動學(xué)分析提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；AE-240S型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-100型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）；3K15型離心機（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

番木鱉堿（批號:110705-200306）、馬錢子堿（批號:110706-200505）、石杉堿甲（批號:100243-200601）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；番木鱉堿氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物對照品（德國Carl GmBH公司，純度均＞98%）；十二烷基硫酸鈉為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:HYP-ODS C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-0.2%十二烷基硫酸鈉溶液（40∶60，V/V，pH2.8）；流速:1.0ml/min；柱溫:30 ℃；檢測波長:254nm；進(jìn)樣量:20μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒質(zhì)量的番木鱉堿、馬錢子堿、番木鱉堿氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物對照品適量，用流動相溶解并定容至同一25ml量瓶中，制備成質(zhì)量濃度分別為0.356mg/ml（番木鱉堿）、0.357mg/ml（馬錢子堿）、0.356mg/ml（番木鱉堿氮氧化物）、0.355mg/ml（馬錢子堿氮氧化物）的混合對照品溶液，即為混合對照品母液，4℃貯藏，備用。精密移取混合對照品母液0.5ml，置1ml量瓶中，用甲醇定容，混勻，即為混合對照品系列溶液①。再分別精密移取混合對照品系列溶液①3ml，置10ml量瓶中，用甲醇定容，混勻，為混合對照品系列溶液②。然后分別精密移取混合對照品系列溶液②0.5、1、5、10、20、50ml，置50ml量瓶中，用甲醇定容，混勻，得混合對照品系列溶液③～⑧，其中番木鱉堿的質(zhì)量濃度分別為0.53、1.07、5.34、10.68、21.36、53.40μg/ml，馬錢子堿的質(zhì)量濃度分別為0.54、1.07、5.36、10.71、21.42、53.55μg/ml，番木鱉堿氮氧化物的質(zhì)量濃度分別為0.53、1.07、5.34、10.68、21.36、53.40μg/ml，馬錢子堿氮氧化物的質(zhì)量濃度分別為0.53、1.06、5.33、10.65、21.30、53.25μg/ml。4 ℃貯藏，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒質(zhì)量的石杉堿甲對照品適量，以甲醇溶解制得質(zhì)量濃度為40.02μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。4℃貯藏，備用。

2.2.3 質(zhì)控樣品的制備 分別取“2.2.1”項下混合對照品系列溶液10μl與內(nèi)標(biāo)液10μl，置50μl空白血漿中，得高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，即番木鱉堿血漿濃度分別為53.40、10.68、0.50μg/ml、馬錢子堿血漿濃度分別為53.55、10.71、0.54μg/ml、番木鱉堿氮氧化物血漿濃度分別為53.40、10.68、0.50μg/ml，馬錢子堿氮氧化物血漿濃度分別為53.25、10.65、0.53μg/ml。－20℃貯藏，備用。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取人血漿樣品50μl，加入“2.2.1”項下混合對照品系列溶液50μl、石杉堿甲20μl、氨水20μl，渦旋2min，再加入乙腈600μl沉淀蛋白，渦旋3min，以離心半徑為13.5 cm、15000 r/min離心 5min，取上清液20μl進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專屬性 取“2.2.3”項下中質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液適量，按“2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，馬錢子堿氮氧化物、石杉堿甲、番木鱉堿氮氧化物、番木鱉堿和馬錢子堿的保留時間分別為3.5、5.2、7.3、24.7、30.8min，血漿中所含的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標(biāo)的測定，且峰形良好。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.馬錢子堿氮氧化物；2.石杉堿甲；3.番木鱉堿氮氧化物；4.番木鱉堿；5.馬錢子堿Fig 1 HPLC chromatograms1.brucine N-oxide；2.huperzine A；3.strychnine N-oxide；4.strychnine；5.brucine

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“2.2.1”項下混合對照品系列溶液③～⑧，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，待測物的峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍（n＝6）Tab 1 Regression equation and linear range（n＝6）

2.4.3 精密度試驗 按“2.2.3”項下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定日內(nèi)精密度（6次）、日間精密度（6 d）。結(jié)果，番木鱉堿、馬錢子堿、番木鱉堿氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物日內(nèi)、日間精密度的RSD均小于9.0%，表明本方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下中質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品溶液5份，置4℃下24h后測定，考察血漿樣品的短期穩(wěn)定性；另取該溶液5份，貯藏于－70℃，30d后測定，考察血漿樣品的長期穩(wěn)定性；再取該溶液5份，在室溫中充分解凍，然后再次冷凍，每次間隔24h，重復(fù)3個凍融周期后測定，考察血漿樣品的3周期凍融穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of stability tests（n＝5）

2.4.5 提取回收率試驗 取“2.2.3”項下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品適量，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。與未經(jīng)處理的相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液峰面積比較，計算番木鱉堿、馬錢子堿、番木鱉堿氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物的回收率，結(jié)果見表3。

表3 提取回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of extraction recovery tests（n＝6）

3 討論

馬錢子在炮制為制馬錢子過程中，番土鱉堿和馬錢子堿可轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的氮氧化合物[6]，可能在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化為極性更高的氮氧化合物，而且其氮氧化合物與原生物堿的藥理藥效相當(dāng)[7]，因此研究番土鱉堿、馬錢子堿、番土鱉堿氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物具有參考價值。

2010年版《中國藥典》對番木鱉堿和馬錢子堿進(jìn)行HPLC測定，流動相為庚烷磺酸鈉[8]，本課題組參考文獻(xiàn)[9]的流動相用十二烷基硫酸鈉替代庚烷磺酸鈉，調(diào)pH為2.8，未加磷酸二氫鈉，流動相的制備更方便簡單，也獲得了較好的分離效果。

番木鱉堿、馬錢子堿、番木鱉堿氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物均為堿性物質(zhì)[10]，本研究采用氨水堿化血樣，使得各生物堿以游離分子形式存在，從而提高了生物堿從血漿提取的效率，與王丹丹等[11-12]采用三乙胺作為流動相有相似的原理。有研究采用氯仿提取并溶解番木鱉堿，但筆者篩選了幾種有機溶液，發(fā)現(xiàn)乙腈的提取率最高，而采用氯仿提取時處理有難度，且番木鱉堿在放置過程中有降解，與文獻(xiàn)結(jié)果相似[13]。

綜上所述，本研究采用RP-HPLC法同時測定人血漿中馬錢子4種生物堿的含量，本方法簡單、快速、靈敏和準(zhǔn)確，可以作為馬錢子4種生物堿的藥動學(xué)研究方法。

[1]趙立民，劉玉國，徐恒衛(wèi).馬錢子堿對大鼠慢性胃炎胃癌癌前病變模型的保護(hù)作用研究[J].中國藥房，2012，23（35）:3285.

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[3]Yin W，Deng XK，Yin FZ，et al.The cytotoxicity induced by brucine from the seed of Strychnos nux-vomica proceeds via apoptosis and is mediated by cyclooxygenase 2 and caspase 3 in SMMC 7221 cells[J].Food Chem Toxicol，2007，45（9）:1700.

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[7]Chen X，Lai Y，Cai Z.Simultaneous analysis of strychnine and brucine and their major metabolites by liquid chromatography-electrospray ion trap mass spectrometry[J].J Anal Toxicol，2012，36（3）:171.

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