高致病性豬藍(lán)耳病免疫金標(biāo)試紙條的研制與應(yīng)用

吳 斌，張秀云，屈 菲，鄭 勇，蘇 旺

（遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001）

高致病性豬藍(lán)耳?。℉P PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱豬藍(lán)耳病，PRRS）病毒變異株引起豬的一種急性、高熱性、高致死性傳染病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30 %以上，育肥豬也可發(fā)病死亡。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將高致病性豬藍(lán)耳病列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病，加以重點(diǎn)防控[1-3]。尤其近年來(lái)高致病性豬藍(lán)耳病的出現(xiàn)已經(jīng)成為規(guī)?；i場(chǎng)的主要疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。膠體金免疫層析試紙條技術(shù)是一種無(wú)需專業(yè)技術(shù)人員對(duì)微量樣品即可檢測(cè)的快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、結(jié)果容易判定的檢測(cè)方法[4]。本研究制備的高致病性豬藍(lán)耳病抗原免疫金標(biāo)試紙條具備敏感、特異的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)大大縮短檢測(cè)時(shí)間，僅十幾分鐘就可完成。這種快速便捷的檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病的新型檢測(cè)技術(shù)具備廣闊的應(yīng)用前景，尤其適用于基層獸醫(yī)部門及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株、臨床樣品和抗體

Marc-145細(xì)胞及高致病性豬藍(lán)耳病病毒SD-4/2006分離株（HP-PRRSV/SD-4/2006）、PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株、豬瘟病毒（CSFV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存；遼寧、上海、江蘇、山東等地7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的60份豬肺臟、脾臟及淋巴結(jié)樣品；純化的抗HPPRRSV單克隆抗體及高致病性豬藍(lán)耳病多抗血清由本研究課題制備提供。

1.2 試劑與材料

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）、氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）、羊抗鼠 IgG二抗、牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4均為國(guó)產(chǎn)分析純；Tween20為化學(xué)純；硝酸纖維素膜（NC膜）購(gòu)自美國(guó)Whatman公司；玻璃纖維、吸水紙購(gòu)自美國(guó)基因公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

Biodot XYZ 3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)、Biodot CM4000試紙條切刀機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Biodot公司；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；微波催化合成/萃取儀XH2100A購(gòu)自北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。

1.4 膠體金標(biāo)記抗體的制備

40 nm膠體金顆粒的制備：將98 mL去離子水放入干凈的錐形瓶中，用封口膜封住瓶口，放入微波合成儀中加熱攪拌，溫度上升到65 ℃，穩(wěn)定2～3 min，快速加入1 %的氯金酸1 mL，設(shè)置參數(shù)到95 ℃，當(dāng)溫度上升到95 ℃，穩(wěn)定2～3 min，快速加入1 mL 1%的檸檬酸三鈉，反應(yīng)約2～3 min，顏色發(fā)生變化直至呈酒紅色，穩(wěn)定3 min后取出，繼續(xù)攪拌至室溫。

金標(biāo)抗體最適pH值的測(cè)定：取1.5 mL離心管，分別加入1 mL膠體金溶液，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)pH值至7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。取酶標(biāo)板8孔，分別加入200 μL不同pH值的膠體金鋪底，每孔再分別加10 μL單抗，震蕩反應(yīng)30 min后，每孔加20 μL 10% NaCl溶液，震蕩反應(yīng)15min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)，在520 nm波長(zhǎng)條件下，選擇OD值最高的那一點(diǎn)處的pH值為最適的pH值。

金標(biāo)抗體的最佳濃度確定：將純化的高致病性豬藍(lán)耳病病毒多抗稀釋至0.2 mg/mL，取酶標(biāo)板11孔，按表1順序依次加入：每孔200 μL膠體金鋪底，取不同體積多抗加入，去離子水補(bǔ)足體積。震蕩反應(yīng)30min后，每孔加入20 μL 10% NaCl溶液，震蕩反應(yīng)15 min。膠體金與抗體達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各孔仍保持紅色不變，同時(shí)用酶標(biāo)儀檢測(cè)，在520 nm波長(zhǎng)條件下，選擇OD值穩(wěn)定的含抗體量最低孔即為200 μL膠體金所需抗體的量。

表1 膠體金標(biāo)記抗體最低穩(wěn)定量的測(cè)定

金標(biāo)抗體的制備：用0.1 moL/L K2CO3調(diào)節(jié)1 mL膠體金溶液pH值至最適值。攪拌條件下，將最適抗體量緩慢加入膠體金溶液中，室溫反應(yīng)30 min，加入 600 μL 10 % BSA 封閉 30 min，12000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀物用1 mL TBS（Tris-HCl 0.01 moL/L、0.02 % NaN3、1 %蔗糖、1 %BSA）混懸30 min，12000 r/min，4 ℃離心，棄上清，0.1 mL TBS重懸，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫層析試紙條的組裝

樣品墊、結(jié)合墊（含金標(biāo)高致病性豬藍(lán)耳病病毒多抗，干燥）、硝酸纖維素膜（檢測(cè)線：HPPRRSV單克隆抗體1 mg/mL；質(zhì)控線：羊抗鼠IgG二抗1 mg/mL），吸水墊依次貼在帶有粘合劑的PVC背板上，切成4 mm寬的試紙條，室溫干燥備用。

1.6 金標(biāo)試紙條效果驗(yàn)證及結(jié)果判定

陰陽(yáng)性檢測(cè)試驗(yàn)：分別將200μL接種Marc-145細(xì)胞的HP-PRRSV/SD-4/2006液和無(wú)HPPRRSV/SD-4/2006的細(xì)胞培養(yǎng)液滴加到試紙條的樣品墊上，查看結(jié)果是否與預(yù)期結(jié)果一致。

敏感性試驗(yàn)：按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。用試紙條對(duì)病毒增殖液進(jìn)行檢測(cè)，以能夠出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低TCID50病毒含量確定該試紙條的靈敏度。同時(shí)以純化的滅活高致病性豬藍(lán)耳病病毒（HP-PRRSV/SD-4/2006）為檢測(cè)對(duì)象，先用稀釋液10倍稀釋，然后做系列倍比稀釋，分別將倍比稀釋的病毒液滴加到試紙條樣品墊上，確定出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低病毒含量。

特異性試驗(yàn)：3份不同稀釋度的高致病性豬藍(lán)耳病病毒（HP-PRRSV/SD- 4/2006）細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，樣品標(biāo)記為1、2、3；3份不同稀釋度的PRRSV （ATCC VR2332）細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，樣品標(biāo)記為4、5、6；2份豬細(xì)小病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，樣品標(biāo)記為7、8；2份豬偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品標(biāo)記為9、10；2份豬流行性乙型腦炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品，樣品標(biāo)記為11、12。用組裝的試紙條檢測(cè)以上樣品，驗(yàn)證其特異性。

重復(fù)性試驗(yàn)：將不同批次的試紙條分別檢測(cè)5份陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)液和5份陰性細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將高致病性豬藍(lán)耳病抗原金標(biāo)試紙條分別放在不同條件下貯存：37 ℃1周、4 ℃半年，每隔1月取出對(duì)相同的陽(yáng)性與陰性參考樣本進(jìn)行測(cè)試。

臨床樣品的檢測(cè)：將遼寧、上海、江蘇、山東7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的60份豬肺臟、脾臟及淋巴結(jié)樣品病料中加入5倍體積的PBS研磨，反復(fù)凍融三次，8000 r/min離心15 min，取上清，樣品分為兩份，一份按照農(nóng)業(yè)部推薦的高致病性藍(lán)耳病試劑盒的診斷方法（RT—PCR方法）進(jìn)行檢測(cè)，一份應(yīng)用本研究制備的高致病性豬藍(lán)耳病抗原金標(biāo)試紙條方法檢測(cè)，每份樣品設(shè)置重復(fù)[4]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 膠體金的表面特征

制備的膠體金溶液呈酒紅色，透光性好。電鏡下觀察顆粒大小一致，分布均勻，平均直徑約為40 nm（圖1）。

2.2 最適pH值和最適抗體標(biāo)記量的優(yōu)選

圖1 膠體金電鏡結(jié)果

從圖2和圖3可以看出，當(dāng)pH值在8.5左右，純化的高致病性豬藍(lán)耳病病毒多抗?jié)舛葹? μg/mL時(shí)，金標(biāo)抗體的OD520值最高，說(shuō)明在此條件下，膠體金標(biāo)記抗體的效率最高。因此我們選擇pH 8.0～8.5和多抗?jié)舛?μg/mL作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

圖2 最適pH值的確定

圖3 金標(biāo)抗體最佳濃度的測(cè)定

2.3 陰、陽(yáng)性試驗(yàn)

HP-PRRSV/SD-4/2006細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性液（1、2）的試紙條在檢測(cè)線處和質(zhì)控線處各出現(xiàn)一條紅色條帶，而滴加無(wú)HP-PRRSV/SD-4/2006的細(xì)胞培養(yǎng)液（3、4）的試紙條只在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶（圖4）。試驗(yàn)證明：所研制的試劑條能準(zhǔn)確地檢測(cè)樣品中是否含有高致病性豬藍(lán)耳病。

圖4 陰陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn)

病毒接種后Marc-145細(xì)胞后培養(yǎng)3 d，待出現(xiàn)病變，按Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50。測(cè)定HP-PRRSV/SD-4/2006病毒的TCID50為10-8/mL。經(jīng)試紙條檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低病毒含量為100 TCID50，以該值確定為高致病性豬藍(lán)耳病免疫金標(biāo)抗原試紙條的靈敏度檢測(cè)限。同時(shí)應(yīng)用該試紙條可檢測(cè)到1:1280稀釋倍數(shù)的病毒稀釋液，病毒含量為0.214mg/L（表2）。

表2 金標(biāo)試紙條敏感性試驗(yàn)

2.5 特異性試驗(yàn)

使用制備的金標(biāo)試紙條檢測(cè)12個(gè)待測(cè)樣品，除與HP-PRRSV/SD-4/2006有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)外，與PRRSV（ATCC VR2332）也有部分的較弱反應(yīng)，而與其他病毒樣品均不反應(yīng)（表3）。

表3 金標(biāo)試紙條特異性試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

將不同批次的試紙條分別檢測(cè)5份陽(yáng)性樣品和5份陰性樣品，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。結(jié)果顯示不同批次的試紙條檢測(cè)結(jié)果都一致，表明試紙條具有較好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用不同貯存條件下取出的試紙條，對(duì)相同的陽(yáng)性與陰性參考樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試時(shí)PRRSV陽(yáng)性與陰性結(jié)果均成立，同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明不同貯存條件下的試紙條，顯色程度與顯色時(shí)間無(wú)明顯差異，說(shuō)明其穩(wěn)定性較好。實(shí)驗(yàn)證實(shí)制備的試紙條可在4 ℃條件下至少保存半年。

2.8 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)送檢的來(lái)自遼寧、上海、江蘇、山東7個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的60份豬肺臟、脾臟及淋巴結(jié)樣品，分別應(yīng)用試紙條和農(nóng)業(yè)部推薦的高致病性藍(lán)耳病診斷試劑盒的方法（RT—PCR方法）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，應(yīng)用該高致病性豬藍(lán)耳病抗原免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)出10份陽(yáng)性樣品，利用高致病性藍(lán)耳病RT—PCR診斷試劑盒檢測(cè)出11份陽(yáng)性樣品（圖5），兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)91 %（10/11）。

圖5 臨床樣品的RT—PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前，高致病性豬藍(lán)耳病主要檢測(cè)方法為RT—PCR檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)法，這兩種檢測(cè)方法都需要專業(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和相應(yīng)的人員。而免疫金標(biāo)試紙條檢測(cè)法檢測(cè)簡(jiǎn)便快捷，無(wú)設(shè)備和人員要求，具有更加廣泛的應(yīng)用性。

膠體金溶液可與多種生物大分子結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物，已應(yīng)用于血清學(xué)試驗(yàn)、細(xì)胞生物學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。膠體金制備方法很多，但采用檸檬酸鈉還原法制備單一粒度的膠體金顆粒效果較好。在制備膠體金過(guò)程中，影響因素很多，如使用的容器必須清潔，否則將導(dǎo)致金溶膠混濁或顆粒大小不勻；在試驗(yàn)中，對(duì)玻璃容器采用5’-二氯二甲硅烷的氯仿溶液硅化處理；還原劑檸檬酸鈉必須一次性快速加入，攪拌均勻，一次制備的量不宜過(guò)多；試劑溶液均需用四蒸水配制，并用微孔濾膜過(guò)濾。制備的膠體金存放于4℃?zhèn)溆茫霸鐦?biāo)記，避免放置過(guò)程中出現(xiàn)自凝或細(xì)菌生長(zhǎng)[4-5]。金溶膠與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例是影響標(biāo)記成功與否的一個(gè)重要因素。因此，在每次標(biāo)記時(shí)，都要測(cè)定二者具體的穩(wěn)定點(diǎn)，以獲得最佳標(biāo)記率。

為了建立敏感可靠的高致病性藍(lán)耳病膠體金免疫層析檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)選用抗高致病性藍(lán)耳病病毒的多抗，減少了非特異性反應(yīng)，提高了反應(yīng)的特異性，且多抗的制備簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)，抗體濃度高且反應(yīng)靈敏。本實(shí)驗(yàn)制備的高致病性豬藍(lán)耳病試紙條，與豬藍(lán)耳病經(jīng)典毒株P(guān)RRSV（ATCC VR2332）有部分較弱的反應(yīng)，說(shuō)明該試紙條在檢測(cè)區(qū)分高致病性豬藍(lán)耳病病毒和經(jīng)典型豬藍(lán)耳病病毒方面的精準(zhǔn)性上，還需進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。分析原因可能是高致病性豬藍(lán)耳病是PRRSV （ATCC VR2332）NSP2基因存在30個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失的變異株，同源性很高[6，7]，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。如針對(duì)變異基因設(shè)計(jì)制備金標(biāo)單克隆抗體，會(huì)提高其特異性，但成本相應(yīng)變高。試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫金標(biāo)試紙條是一種實(shí)驗(yàn)原料來(lái)源容易，可作為監(jiān)測(cè)和診斷高致病性藍(lán)耳病的常規(guī)手段，易于推廣使用。但由于技術(shù)限制造成它的檢測(cè)靈敏度低，尚不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，故這類免疫金標(biāo)試紙條主要用以檢測(cè)正常體液中是否存在的生物活性物質(zhì)（如傳染病的抗原及抗體），因此該方法目前常作為初期篩查，用于疾病的輔助診斷。

[1]劉業(yè)兵，鄭杰，寧宜寶.高致病性PRRSV（HuN株）NSP2基因的擴(kuò)增與分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2007，41（10）：10-12.

[2]楊漢春.我國(guó)豬繁殖與呼吸綜合征的流行現(xiàn)狀與控制對(duì)策動(dòng)態(tài)[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2004（5）：112-115.

[3]孫慶申，仇華吉，童光志等.豬繁殖與呼吸綜合征單克隆抗體研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，22（4）：25-28.

[4]任先平.膠體金標(biāo)記抗體技術(shù)[J].免疫學(xué)雜志，1989，5（1）：62.

[5]崔尚金，姜建宏，周艷君.豬繁殖與呼吸綜合征膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)的建立和初步應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，27（3）：213-216.

[6]Allende R，Lewis T L，Lu Z，et a1.North American and European porcine reproductive respiratory syndrome viruses different non-structural protein coding regions[J].Gen Virol，1999，80（2）：307-315.

[7]童光志，周艷君，郝曉芳.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29（5）：323-326.