NDV 江蘇分離株F基因的克隆與序列分析

王善輝，謝金文，王文秀，成子強(qiáng)

（1.江蘇省徐州生物工程職業(yè)技學(xué)院，江蘇 徐州； 2.山東省農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600）

新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的禽類(lèi)烈性傳染病，可導(dǎo)致雞群大量發(fā)病和死亡，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將ND列為法定報(bào)告?zhèn)魅静?。NDV是副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬的成員，為有囊膜的單股、負(fù)鏈RNA病毒[1]。病毒基因組全長(zhǎng)15 kb，編碼6種蛋白，其中F蛋白是NDV主要糖蛋白之一，具有良好的免疫原性，能提供免疫保護(hù)作用。NDV復(fù)制時(shí)，病毒粒子產(chǎn)生無(wú)活性前體蛋白（F0），在宿主細(xì)胞蛋白酶作用下，F(xiàn)0前體裂解成兩個(gè)由二硫鍵相連的多肽F1和F2[2]，使子代病毒有感染性。F0裂解位點(diǎn)的氨基酸順序直接影響其裂解能力，從而表現(xiàn)毒力的強(qiáng)弱[3-5]。為此，本研究對(duì)江蘇省不同地區(qū)分離的NDV分離株JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA株的F蛋白基因進(jìn)行克隆測(cè)序，與國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)疫苗株進(jìn)行核苷酸、氨基酸同源性比較，并繪制進(jìn)化樹(shù)，旨在進(jìn)一步從分子水平上探索 NDV分離株與疫苗株和國(guó)內(nèi)外毒株之間存在的遺傳性關(guān)系，以進(jìn)一步了解病毒的演化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌種和載體 所用NDV分離株JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA株系分離于該地區(qū)的某雞場(chǎng)產(chǎn)蛋雞；大腸桿菌DH5α由本室保存；pMD18-T戴體購(gòu)自Takara 公司。

1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、各種限制性?xún)?nèi)切酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA Marker、dNTP、RNasin、DNA純化回收試劑盒等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；無(wú)特定病原體（SPF）雞胚，購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所；Trizol試劑、DEPC（焦碳酸二乙酯）購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的NDV F基因核苷酸序列，應(yīng)用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在其易發(fā)生變異位點(diǎn)合成簡(jiǎn)并堿基。引物序列分別為：

P1：5'-ATGGGCTCY（C/T）AR（A/G）ATCTTCTACC-3’

P2：5'-CGTTCATR（G/A）CTY（C/T）TTGTR （A/G）GTGGCTCTC-3’

1.4 病毒增殖 取10日齡SPF雞胚，尿囊腔接種病毒（每枚接種1000倍稀釋病毒液100μL），37℃溫箱孵育。收集接毒24h后死亡雞胚的尿囊液，并測(cè)定其血凝效價(jià)，具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

1.5 病毒RNA提取 分別取NDV分離株尿囊液各400μL，以10000r/min離心10min，取上清，加入等體積Trizol液，根據(jù)Trizol RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取病毒基因組。

1.6 F基因的RT-PCR擴(kuò)增 將提取的RNA溶于DEPC水，加入引物P1，按AMV使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，滅活后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為：95℃預(yù)變性5 min； 95℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

1.7 F基因的純化和克隆 電泳后切膠回收PCR產(chǎn)物，具體操作見(jiàn)DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)。然后與pMD18-T載體于16℃連接2h，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)，PCR鑒定陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，酶切鑒定無(wú)誤后送上海生工測(cè)序。

1.8 F基因序列測(cè)定與氨基酸序列分析 應(yīng)用DNAMAN對(duì)所測(cè)得NDV地方株F基因序列與國(guó)內(nèi)外有代表性參考毒株相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和分析，應(yīng)用DNAStar軟件繪制遺傳系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 分離株F基因cDNA 的RT-PCR擴(kuò)增

從新城疫病毒分離株JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA尿囊液中提取的RNA用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果4株NDV分離株均擴(kuò)增出一條約1662bp的特異性條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片段大小相符（圖1）。

圖1 NDV分離株F基因RT-PCR結(jié)果

2.2 分離株F基因重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出一1662bp的片段，與RT-PCR的結(jié)果相一致（圖2）；將PCR鑒定大小相符的重組質(zhì)粒再經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，可見(jiàn)兩條大小分別為1662bp和2692bp左右的條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致，表明所擴(kuò)增的F基因片段均已經(jīng)定向克隆入載體中（圖3）。

圖2 NDV分離株F基因連T載體菌落PCR鑒定結(jié)果

圖3 NDV分離株F基因連T載體雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 F基因序列測(cè)定與氨基酸序列推導(dǎo)

重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明，4個(gè)分離株F基因均包含了完整的開(kāi)放閱讀框，共1662bp，編碼553個(gè)氨基酸。應(yīng)用DNAMAN軟件推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在JSSZ和JSXZ 兩個(gè)分離株在其裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112-R-R-Q-K-R-F-117，符合強(qiáng)毒株裂解區(qū)氨基酸組成的特征；而JSHA和JSLYG兩個(gè)分離株的112至117位氨基酸序列與強(qiáng)毒株的征性氨基酸序列不相符，且與MDT和ICPI的測(cè)定結(jié)果相吻合。

2.4 F基因核苷酸及氨基酸序列同源性比較

4個(gè)NDV分離株F基因之間的核苷酸序列同源性不高，為73.3%～94.9%（平均87.65%）；氨基酸同源性為74.2%～100%（平均85.96%）；4個(gè)NDV分離株F基因與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F 48E9株之間的核苷酸序列同源性較低，為57.3%～68.4%（平均64.83%），但氨基酸同源性稍高，為79.7%～83.9%（平均81.73%）；4個(gè)NDV分離株F基因與常見(jiàn)疫苗株 LaSota株之間的核苷酸序列同源性也不高，為69.3%～80.8%（平均75.03%）。氨基酸同源性較差別較大，其中JSLYG株與LaSota株的氨基酸同源性較高，為98.3%；JSSZ株和JSHA株與LaSota株的氨基酸同源性分別為92.4%和92.7%；JSXZ株與LaSota株的氨基酸同源性最低，為78.2%。

2.5 F基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析

圖4 NDV F基因核苷酸同源性比較

圖5 NDV F基因氨基酸同源性比較

圖6 NDV各分離株在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中的地位

應(yīng)用DNA Star分析軟件將獲得的4株NDV分離株以及其他幾十株國(guó)內(nèi)外有代表性的 NDV毒株的F基因，均截為374bp（從ATG起～374bp）長(zhǎng)度，繪制NDV F基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖6）。從進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果來(lái)看，NDV可分為9個(gè)基因型（Ⅰ～Ⅸ），所克隆的4個(gè)分離株中，JSXZ株與登錄號(hào)為AF358788的臺(tái)灣分離株位于同一個(gè)分枝上， 與JSSZ株遺傳關(guān)系最近，為基因Ⅷ型；JSLYG與JSHA株同在一個(gè)分支上，與Clone-30株遺傳關(guān)系最近，為基因 Ⅸ 型，也是國(guó)內(nèi)流行的基因型。

3 討論

NDV F基因的遺傳變異與NDV的變異和流行密切相關(guān)，是NDV分子流行病學(xué)研究的首選基因。F蛋白是構(gòu)成NDV致病性的分子基礎(chǔ)，NDV復(fù)制時(shí)，病毒粒子產(chǎn)生無(wú)活性前體蛋白（F0），在宿主細(xì)胞蛋白酶作用下，F(xiàn)0前體裂解成兩個(gè)由二硫鍵相連的多肽F1和F2，使子代病毒有感染性。F蛋白能否被裂解取決于F蛋白的裂解位點(diǎn)區(qū)（112-117）處氨基酸組成和宿主細(xì)胞的特性，F(xiàn)0裂解位點(diǎn)堿性氨基酸殘基的多少與病毒的毒力相關(guān)，由于強(qiáng)、弱毒株裂解位點(diǎn)的差異，使其對(duì)酶裂解的敏感性不同。本研究成功克隆了NDV JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA毒株的F基因，將其克隆至pMD18 T載體中，并進(jìn)行測(cè)序和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。為從分子生物學(xué)角度分析江蘇省新城疫病毒變異情況打下良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為新城疫的診斷與防治方法的研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為控制本病的蔓延提供了可靠的理論依據(jù)。從4個(gè)毒株的F基因測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在JSSZ和JSXZ 2個(gè)分離株在其裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112-R-R-Q-K-R-F-117，符合強(qiáng)毒株裂解區(qū)氨基酸組成的特征；而JSHA和JSLYG兩個(gè)分離株的112至117位氨基酸序列與強(qiáng)毒株的征性氨基酸序列不相符，且與MDT和ICPI的測(cè)定結(jié)果相吻合。

對(duì)所分離NDV的4個(gè)江蘇分離毒株的F基因序列比對(duì)分析結(jié)果表明，4個(gè)毒株之間的核苷酸序列同源性不高，為73.3%～94.9%；4個(gè)毒株與常用國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9株之間的核苷酸序列同源性較低，為57.3%～68.4%，說(shuō)明分離毒株與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9株存在致病性差異；與常用疫苗株LaSota株之間核苷酸序列同源性也只有69.3%～80.8%，這揭示我國(guó)不同年代、不同省區(qū)分離的NDV毒株之間以及與疫苗毒株之間在基因水平存在較大差異，這種差異對(duì)氨基酸及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有一定影響，很可能是造成弱毒株免疫效果不確實(shí)的一個(gè)重要原因。

最初，研究者根據(jù)NDV F基因全長(zhǎng)序列分析繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)F基因的1～374位的核苷酸序列具有很好的代表性，根據(jù)其繪制的進(jìn)化樹(shù)和全長(zhǎng)序列繪制的完全一致，并且與當(dāng)?shù)氐牧餍胁W(xué)資料符合性很好，是進(jìn)行ND分子流行病學(xué)研究的良好材料[6-8]。所以本研究以分離的4個(gè)NDV江蘇毒株F基因的1～374bp的核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果來(lái)看，NDV可分為9個(gè)基因型（Ⅰ～Ⅸ），所克隆的4個(gè)分離株中，JSXZ株與AF358788的臺(tái)灣分離株在同一個(gè)分支上，和JSSZ株遺傳關(guān)系最近，為基因Ⅷ型[9]；JSLYG與JSHA株同在一個(gè)分支上，與Clone-30株遺傳關(guān)系最近，為基因 Ⅸ 型，也是國(guó)內(nèi)流行的基因型。

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