腸膜明串珠菌6055生產(chǎn)低聚葡萄糖的研究

張 寅，干蘇靈，張柏林，*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083;2.江蘇綠揚(yáng)現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇揚(yáng)州225105)

功能性低聚糖通常被稱作“益生元”，是一類由2～10個(gè)單糖通過糖苷鍵連接形成的短鏈糖類聚合物，分子量約為 300～2000u［1］。大多數(shù)低聚糖具有整腸、低熱量、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效［2－3］。功能性低聚葡萄糖因其能夠選擇性刺激腸道中有益微生物的生長和活力，而被廣泛應(yīng)用到多種功能性食品當(dāng)中［4－5］。

低聚糖可以通過多條途徑獲得［6－8］，包括:a.從植物材料中提取(如低聚半乳糖和低聚果糖);b.多糖的限制性酶解(如低聚木糖和低聚果糖);c.酶促合成(如低聚果糖，β－低聚半乳糖，β－低聚葡萄糖和α－低聚葡萄糖)。目前，國內(nèi)主要通過淀粉水解制備低聚葡萄糖，但是其制備的功能性低聚糖產(chǎn)物中存在較多的單糖、二糖和麥芽糊精，它們都屬于能被人體消化和吸收的碳水化合物，不能夠選擇性的刺激腸道中有益微生物的生長和活力，極大的降低了功能性低聚糖的功效，而且該方法成本較高，導(dǎo)致低聚糖在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到很大的限制。

腸膜明串珠菌自身能夠合成多種關(guān)鍵酶，如葡聚糖蔗糖酶和蔗糖磷酸化酶［9］。在有蔗糖存在的條件下，腸膜明串珠菌能夠利用葡聚糖蔗糖酶催化生成聚合度不同的低聚糖［10－11］。腸膜明串珠菌NRRLB－18242代謝生成的α－低聚葡萄糖對(duì)腸道中的多種消化酶具有極高的耐受性［12］。本研究嘗試采用生物發(fā)酵法制備功能性低聚糖，通過對(duì)腸膜明串珠菌6055發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、產(chǎn)物低聚葡萄糖的純化及其益生性等方面的研究，旨在建立利用腸道明串珠菌發(fā)酵制備功能性低聚葡萄糖的具體工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroides 6055)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae BJFU9.0017)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC);嗜酸乳桿菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum Bb－02)商業(yè)化益生菌菌株 由上海丹尼斯克公司提供。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、果糖和潘糖(色譜級(jí))Sigma公司;商業(yè)低聚葡萄糖(純度95%)上海三豐生物技術(shù)有限公司;其他試劑 均為分析純。G1362A示差折光檢測(cè)器、Agilent1200高效液相色譜儀 迪馬公司;UV3010紫外可見分光光度計(jì) 日立公司;PHSI－3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;FA1604N電子分析天平 上海天平儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 低聚葡萄糖定量測(cè)定

1.2.1.1 糖標(biāo)樣的制備 精密稱取麥芽糖、蔗糖、甘露醇、潘糖和果糖標(biāo)樣各100mg，加去離子水溶解，于250mL容量瓶中定容，搖勻備用。

1.2.1.2 樣品溶液的制備 離心除去發(fā)酵液中的細(xì)胞，上清液經(jīng)0.4μm濾膜過濾，去離子水稀釋4000倍后利用Agilent1200高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析。

1.2.1.3 色譜條件 G1362A示差折光檢測(cè)器;色譜柱:Inertsil SIL－100A NH2(4.5×250mm，迪馬公司);柱溫:室溫;流動(dòng)相:乙腈∶水 =75∶25(V/V);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.2 菌株的培養(yǎng)

1.2.2.1 膜明串珠菌6055的培養(yǎng) 將活化三代的膜明串珠菌6055接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于30℃下恒溫培養(yǎng)18h，測(cè)定菌體發(fā)酵液中低聚葡萄糖的產(chǎn)量及菌體細(xì)胞生物量。

1.2.2.2 釀酒酵母的培養(yǎng) 將活化三代的釀酒酵母以2%的比例接種于200mL YEPD培養(yǎng)基中，在30℃恒溫條件下以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)18h。發(fā)酵液在8000×g轉(zhuǎn)速下冷凍離心20min，棄去上清液保留酵母細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞生物量測(cè)定 離心分離培養(yǎng)的菌體細(xì)胞，生理鹽水洗滌后進(jìn)行梯度稀釋，利用UV3010紫外可見分光光度計(jì)于600nm處測(cè)其吸光度A值，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞干重C(g/L)，繪制吸光度A值與細(xì)胞干重的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度A值，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出菌體的細(xì)胞干重。

1.2.4 菌株6055產(chǎn)低聚葡萄糖發(fā)酵條件的優(yōu)化研究1.2.4.1 菌株培養(yǎng)基的優(yōu)化 以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別考察蔗糖與麥芽糖比例、氮源、微量元素對(duì)膜明串珠菌6055低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響。

1.2.4.2 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化 根據(jù)高莉莉等關(guān)于腸膜明串株菌6055培養(yǎng)的單因素實(shí)驗(yàn)［13］對(duì)接種量、初始pH培養(yǎng)、溫度三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，分別記為變量A、B、C，每個(gè)因素取3個(gè)水平;以低聚葡萄糖產(chǎn)量為響應(yīng)值，記為Y;利用Box－Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。按照實(shí)驗(yàn)方案，不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)腸膜明串珠菌6055。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 低聚葡萄糖的純化研究 菌株6055發(fā)酵液離心后取上清液進(jìn)行冷凍濃縮，制備低聚葡萄糖濃縮液。以2.0%(v/v)的接種量，將活化好的釀酒酵母接入250mL低聚葡萄糖濃縮液中，30℃下100r/min振蕩培養(yǎng)36h。每隔4h取樣，HPLC法檢測(cè)上清液中低聚葡萄糖、雙糖和單糖的含量變化(g/L)。

1.2.6 低聚葡萄糖益生性的研究 將實(shí)驗(yàn)制得的低聚葡萄糖溶于MRS和TPY培養(yǎng)基中，配成2%低聚葡萄糖培養(yǎng)基，滅菌后分別接入嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌，37℃厭氧培養(yǎng)24h，以添加葡萄糖的培養(yǎng)基作為對(duì)照，采用比濁法和活菌計(jì)數(shù)法研究低聚葡萄糖對(duì)嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌生長情況的影響，菌落數(shù)表達(dá)為log CFU/mL。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，并通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，利用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響

2.1.1 菌株培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1.1 蔗糖與麥芽糖比例 以蔗糖和麥芽糖為碳源，在其總量為150g/L的前提下，選擇蔗糖和麥芽糖的添加比例分別為 2∶1，4∶1，5∶1，7∶1，測(cè)得低聚葡萄糖的產(chǎn)量及菌體細(xì)胞生物量如圖1所示。由圖可知，當(dāng)蔗糖和麥芽糖比例為2∶1時(shí)，低聚葡萄糖的產(chǎn)量最高，為1.82g/L;此時(shí)，菌株6055表現(xiàn)出最好的生長狀態(tài)，菌體細(xì)胞生物量達(dá)到0.48g/L。菌體的生長情況與低聚糖產(chǎn)量呈正相關(guān)。

圖1 不同碳源對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量及腸膜眀串珠菌6055生長的影響Fig.1 Effect of different carbohydrates sources on synthesis of oligosaccharides and the growth of Leuconotoc mesenteroides

2.1.1.2 氮源 以1%的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨和硫酸銨為氮源，測(cè)得低聚葡萄糖的產(chǎn)量及菌體細(xì)胞生物量如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)添加酵母膏作為氮源時(shí)，低聚葡萄糖的產(chǎn)量最高，為2.08g/L;此時(shí)，菌株6055表現(xiàn)出較好的生長狀態(tài)，菌體細(xì)胞生物量達(dá)到0.47g/L。菌體的生長情況與低聚糖產(chǎn)量呈正相關(guān)。

圖2 不同氮源對(duì)低聚糖葡萄產(chǎn)量和腸膜眀串珠菌生長的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on synthesis of oligosaccharides and the growth of Leuconotoc mesenteroides

2.1.1.3 微量元素 在培養(yǎng)基中分別添加0.2%的檸檬酸鈉、氯化鈣、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵作為微量元素，測(cè)得低聚葡萄糖的產(chǎn)量及菌體細(xì)胞生物量如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)添加K2HPO4和吐溫80時(shí)，低聚葡萄糖的產(chǎn)量會(huì)明顯提高，其產(chǎn)量分別為2.96和2.80g/L;此時(shí)，菌株6055表現(xiàn)出最好的生長狀態(tài)，菌體細(xì)胞生物量分別為0.51和0.50g/L。菌體的生長情況與低聚葡萄糖產(chǎn)量呈正相關(guān)。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)確定菌株6055的最適培養(yǎng)基為:蔗糖100g/L，麥芽糖50g/L，酵母膏5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，吐溫80 2mL。

2.1.2 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化 根據(jù)高莉莉等關(guān)于腸膜明串株菌6055培養(yǎng)的單因素實(shí)驗(yàn)［13］對(duì)接種量、發(fā)酵溫度和pH進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)1～12為析因點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)13～17為0點(diǎn)，是區(qū)域的中心點(diǎn)。中心實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，以減少誤差。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖3 礦物元素對(duì)低聚糖產(chǎn)量和腸膜眀串珠菌生長的影響Fig.3 Effect of different mineral elements on synthesis of oligosaccharides and the growth of Leuconotoc mesenteroides

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The Box－Behnken experimental design and results

通過SAS軟件的響應(yīng)面回歸過程對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立的各實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)值之間回歸方程如下所示:

回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)(響應(yīng)值)影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來判定。pH和溫度的p值小于0.05，表明其對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響顯著，但接種量的p值大于0.1表明其影響不顯著。溫度和pH交互作用的p值小于0.05，表明其對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響顯著，而接種量和pH與接種量和溫度的交互影響均不顯著。整體的回歸方程的p值小于0.05，回歸方程也是顯著的。相關(guān)系數(shù)R2=0.9989，說明響應(yīng)值(低聚葡萄糖產(chǎn)量)的變化有99.89%來源于所選變量，即接種量，培養(yǎng)溫度和pH。因此，實(shí)驗(yàn)方程與實(shí)際數(shù)據(jù)之間具有非常好的擬合性。

根據(jù)回歸方程，可由SAS軟件作出響應(yīng)面立體圖(圖4～圖6)。由SAS響應(yīng)面優(yōu)化圖可以看出:初始pH和溫度對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響極顯著;接種量對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量也有一定影響，但不顯著。

表3 變量對(duì)應(yīng)值的方差分析及顯著性評(píng)價(jià)Table 3 Analysis of Variance shoeing significance of variables on responses

圖4 接種量(A)和pH(B)對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Response surface plot showing the interactive effects of inoculum concentration and initial pH on glucooligosaccharides yield at a fixed level of lincubation temperature

圖5 接種量(A)和溫度(C)對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of inoculum concentration and lincubation temperature on glucooligosaccharides yield at a fixed level of initial pH

通過軟件分析得到最優(yōu)的培養(yǎng)條件是:接種量為3.02%，發(fā)酵溫度為25.50℃，pH為7.09，在此條件下低聚葡萄糖理論產(chǎn)量是5.09g/L。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析的可靠性，以及實(shí)際操作性，將最優(yōu)參數(shù)修正為接種量3.0%，發(fā)酵溫度25.0℃，pH7.10，此時(shí)低聚葡萄糖產(chǎn)量為5.15g/L，與預(yù)測(cè)值5.09g/L的相對(duì)誤差為1.18%。

圖6 pH(B)和溫度(C)對(duì)低聚葡萄糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of initial pH and lincubation temperature on glucooligosaccharides yield at a fixed level of inoculum concentration

2.2 純化過程中低聚葡萄糖含量的變化情況

純化后離心去除釀酒酵母細(xì)胞，HPLC檢測(cè)上清液中低聚糖、雙糖以及單糖的含量變化情況，結(jié)果如圖7所示。

圖7 利用釀酒酵母純化低聚糖產(chǎn)物Fig.7 Purification of oligosaccharide by fermention with Saccharomyces cerevisiae

由圖7可知，前12h，果糖和葡萄糖含量下降的速度很快;24h內(nèi)，葡萄糖和果糖基本被全部清除。前4h，由于總糖度較高，釀酒酵母的發(fā)酵作用受到抑制，麥芽糖的降解速度相對(duì)較慢;4～12h之間，隨著總糖度的降低，底物抑制作用解除，麥芽糖被迅速降解。前28h，可消除100%的果糖和葡萄糖，以及92.8%的麥芽糖，而低聚葡萄糖幾乎不被降解，從而使低聚葡萄糖占總糖的比例升高至74.3%。因此，本實(shí)驗(yàn)將純化發(fā)酵的時(shí)間確定為28h。

2.3 低聚葡萄糖益生性的研究

將嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌分別接種于以實(shí)驗(yàn)制得低聚葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中，每隔4h取樣，以不含低聚葡萄糖的MRS和TPY培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定培養(yǎng)液的吸光值;菌液10倍遞增稀釋后涂布平板，活菌計(jì)數(shù)。菌體的生長狀況如圖8所示。

由圖8可知，以葡萄糖為碳源時(shí)，嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在12h以后才會(huì)進(jìn)入生長穩(wěn)定期，其最大細(xì)胞生物量僅為0.31和0.35g/L，最大活菌數(shù)僅為8.58和8.99log CFU/mL;而以低聚葡萄糖為碳源時(shí)，菌體在8h時(shí)就已進(jìn)入生長穩(wěn)定期，最大細(xì)胞生物量為0.44和0.54g/L，最大活菌數(shù)為9.05和9.43log CFU/mL。

3 討論

培養(yǎng)基組分明顯影響腸膜明串珠菌產(chǎn)低聚葡萄糖的代謝過程［11，14］。Yoo等人證實(shí)蔗糖和麥芽糖的比例與低聚糖產(chǎn)量有較大關(guān)系［15］。本次研究中證實(shí)，蔗糖和麥芽糖比例不同(即2∶1、4∶1、5∶1 和7∶1)低聚糖產(chǎn)量不同，蔗糖和麥芽糖的比例越低低聚糖的產(chǎn)量越大，即當(dāng)蔗糖和麥芽糖的比例為2∶1時(shí)低聚糖的產(chǎn)量最大。Martha Argüello－Morales等人證實(shí)酪蛋白、細(xì)菌蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉等氮源與膜明串珠菌低聚糖產(chǎn)量存在較大關(guān)系［16］。本次研究表明，培養(yǎng)基添加的氮源不同，低聚葡萄糖的產(chǎn)量確實(shí)存在明顯的差異:當(dāng)以酵母膏為氮源時(shí)菌株6055的低聚葡萄糖產(chǎn)量可達(dá)到最高;而以硫酸銨為無機(jī)氮源時(shí)，低聚葡萄糖產(chǎn)量最低。吐溫80和磷酸氫二鉀可增加葡聚糖蔗糖酶的活力［17］。本文研究表明，吐溫80和磷酸氫二鉀可以增加葡聚糖蔗糖酶的活力來增加菌株6055低聚葡萄糖的產(chǎn)量。這與F Mozzi等人有關(guān)葡聚糖蔗糖酶的活性越高低聚糖的產(chǎn)量越大的研究結(jié)果是一致的［18］。

腸膜明串株菌產(chǎn)低聚葡萄糖的最適培養(yǎng)條件與菌體的最佳生長條件基本相同［19］。而本次研究得到的菌株6055產(chǎn)低聚葡萄糖的最優(yōu)培養(yǎng)條件是:接種量為3.0%，發(fā)酵溫度為25.0℃，pH為7.10。由《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可知，此時(shí)并沒達(dá)到菌株6055的最佳生長條件，這與Bellengier等人關(guān)于腸膜明串株菌可在亞適宜條件下生成最大量低聚葡萄糖的結(jié)論是一致的［20］。

Harder等人證實(shí)利用微生物發(fā)酵法可去除蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等非功能性低聚糖成分［21］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在37.5%的低聚葡萄糖發(fā)酵液中接入2%的釀酒酵母，發(fā)酵28h后，可除去發(fā)酵液中100%的果糖和葡萄糖、以及92.8%的麥芽糖，使低聚葡萄糖含量升高至74.3%。因此，利用釀酒酵母除去發(fā)酵液中的糖有利于低聚葡萄糖的進(jìn)一步純化。

圖8 低聚葡萄糖對(duì)嗜酸乳桿菌NCFM、雙歧桿菌300B生長的影響Fig.8 Influences of oligosacharide sourees on the growth of Bifidobacterium bifidum 300B and Bacillus acidophilus NCFM

功能性低聚糖作為碳源時(shí)，能夠較為明顯的促進(jìn)雙歧桿菌的生長和繁殖［22－23］。采用本研究獲得的低聚葡萄糖來替代葡萄糖作為碳源時(shí)，商業(yè)化嗜酸乳桿菌的最大細(xì)胞生物量和最大活菌數(shù)分別增加0.13g/L和0.47log CFU/mL，商業(yè)化雙歧桿菌的最大細(xì)胞生物量和最大活菌數(shù)分別增加0.19g/L和0.44log CFU/mL，嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌分別增殖37.9%和48.6%。這一結(jié)果說明采用本篇方法獲得的低聚葡萄糖具有促進(jìn)腸道有益微生物生長的效果，或許可以作為潛在的益生元來應(yīng)用。

4 結(jié)論

4.1 優(yōu)化后腸膜明串珠菌6055發(fā)酵條件可以明顯提高低聚葡萄糖產(chǎn)量，結(jié)合釀酒酵母除糖可以提高功能性低聚葡萄糖的純度，從而獲得了一條完整的腸膜明串珠菌6055發(fā)酵生產(chǎn)功能性低聚葡萄糖的工藝路線。

4.2 當(dāng)采用蔗糖 100g/L，麥芽糖 50g/L，酵母膏5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，吐溫80 2mL的培養(yǎng)基質(zhì)，通過控制3.0%接種量，發(fā)酵溫度25.0℃和pH為7.10發(fā)酵條件，菌株6055發(fā)酵18h生成的低聚葡萄糖量最多，為5.15g/L;進(jìn)一步采用2%的釀酒酵母發(fā)酵28h可以使發(fā)酵液中低聚葡萄糖含量從37.5%升高到74.3%。

［1］Chung C.Production of glucooligosaccharides and mannitol from Leuconostoc mesenteroides B－742 fermentation and its separation from byproducts［J］.Journal of Microbiolgy and Biotechnology，2006，16(2):325－329.

［2］Howard M D，Gordon D T，Pace L W.Effects of dietary supplementation with fructooligosaccharides on colonic microbiota populations and epithelial cell proliferation in neonatal pigs［J］.Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition，1995，21(3):297－303.

［3］Naughton P J，Lind M L，Jensen B B.Effects of nondigestible oligosaccarides on Salmonella enterica serovar typimurium and nonpathogenic Escherichia coli in the pig small intestine in vitro［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(8):3391－3395.

［4］O’SullVian S M，Condon S，Cogan T M.Purification and characterization of acetolacate decarboxylase from Leuconostoc Lactis NCW1［J］.FEMS Microbiology Letters，2001，194(2):245－249.

［5］Marth E H，Steele J.Applied dairy microbiology［M］.New York，Basel:Marcel Dekker，Inc.，2001.

［6］Monsan P F，Paul P.Oligosaccharide feed additives［C］//R.J.Wallace and A.Chesson(Ed.).Biotechnology in Animal Feeds and Animal Feeding.Weinheim，Germany:VCH Velagsgesellshaft mbH，1995:233－245.

［7］Chesson A.Probiotics and other intestinal mediators［C］//D.J.A.Cole，J.Wiseman，and M.A.Varley(eds).Principles of Pig Science.Loughborough，UK:Nottingham University Press，1993:197－214.

［8］Morgan A J，Mul A J，Beldman G.Dietary oligosacchiharidesnew insights［J］.Agro Food Industry Hi－tec，1992，5:35－38.

［9］Kobayashi M，Matsuda K.Electrophoretic analysis of the multiple forms of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides［J］.Journal of Biochemistry，1986，l00(3):615－621.

［10］Kagan B O，Latker S M，Zfasman E M.Phosphorolysis of saccharose by cultures of Leuconostoc mesenteroidesv［J］.Biokhimiya，1942，7:93－108.

［11］Cogan T M，Jordan K N.Metabolism of Leuconostoc baeteria［J］.Journal of Dairy Science，1994，77(9):2704－2717.

［12］AarnikunnasJ，Ronnholm K，PalvaA.Themannitol dehydrogenase gene(mdh)from Leuconostoc mesenteroides is distinct from other known bacterial mdh genes［J］.Applied Microbiology and Biotcehnology，2002，59(6):665－671.

［13］高莉莉.腸膜明串珠菌發(fā)酵生成低聚糖的研究［D］.北京林業(yè)大學(xué)，2009.

［14］Cogan T M.Flavour production by dairy starter cultures［J］.Journal of Applied Bacteriology Symposium Supplement，1995，79:49－64.

［15］Miller A W，Robyt J F.Stabilization of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B－512F by nonionic detergents，poly(ethylene glycol)and high－molecular－weight dextran［J］.Biochim Biophys Acta，1984，785(3):89－96.

［16］Arguello－Morales M，Sanchez－Gonzalez M，Canedo M.Proteolytic rnodification of leuconostoc mesenteroides B－512F dextransucrase［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2005，87(2):131－141.

［17］Neubauer H，Bauche A，Mollet B.Molecular characterization and expression analysis of the dextransucrase DsrD of Leuconostoc mesenteroides Lcc4 in homologous and heterologous Lactococcus lactis cultures［J］.Microbiology，2003，149(4):973－982.

［18］Mozzi F，Oliver G，DE Giori G S.Influence of temperature on the production of exopolysaccharides by thermophilic lactic acid bacteria［J］.Milchwissenschaft，1995，50(2):80－82.

［19］Demirci Y，Hemme D.Growth of Leuconostoc mesenteroides strains isolated from French raw milk cheeses in a reference milk［J］.Milchwissenschaft，1994，49(9):483－485.

［20］Foucaud C.Nutritional requirements of Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroidesand subsp.Dextranicum for growth in milk［J］.Journal of Dairy Research，1997，64(1):95－103.

［21］ClariceM A，Chagas，Honoratp T L.Dextransucrase production using cashew apple juice as substrate:effect of phosphate and yeastextractaddition［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2007，30(3):207－215.

［22］Gmeiner M，Kneifel W，Kulbe K D.Influence of a synbiotic mixture consisting of Lactobacillus acidophilus 74－2 and a fructooligosaccharide preparation on the microbial ecology sustained in a simulation of the human intestinal microbial ecosystem(SHIME reactor)［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2000，53(2):219－223.

［23］Kaplan H， Hutkins R W.Fermentation of fructooligosaccharides by lactic acid bacteria and bifidobacteria［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(6):2682－2684.