柯薩奇病毒B3感染HeLa細(xì)胞后Bax和Bim的表達(dá)*

楊 麗， 李 欣， 田 朗， 黃利華， 李卓穎， 楊作成

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410013)

柯薩奇病毒B3感染HeLa細(xì)胞后Bax和Bim的表達(dá)*

楊 麗， 李 欣， 田 朗， 黃利華， 李卓穎， 楊作成△

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410013)

目的：觀察HeLa細(xì)胞感染柯薩奇病毒B3(CVB3)后Bax和Bim mRNA和蛋白的表達(dá)。方法：將HeLa細(xì)胞分為未予以CVB3感染的對照組和予以CVB3感染的病毒組，取3 h、6 h、9 h、12 h和24 h的細(xì)胞，采用RT-PCR和Western blotting分別檢測Bax和Bim mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果：Bax和Bim mRNA在對照組和病毒組HeLa細(xì)胞中均有表達(dá)，在病毒組和對照組中Bax和Bim mRNA的表達(dá)在各自組內(nèi)均無顯著差異(P＞0.05)，但在24 h Bax和Bim在病毒組mRNA的表達(dá)低于對照組(P＜0.05)。Bax和Bim蛋白表達(dá)在對照組中各時點(diǎn)均有表達(dá)，但無顯著差異(P＞0.05)。病毒組Bax蛋白在24 h表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且病毒組表達(dá)明顯低于對照組(P＜0.05);Bim蛋白的表達(dá)隨感染時間延長而下降(P＜0.05)，9 h、12 h和24 h表達(dá)病毒組低于對照組(P＜0.05)。結(jié)論：Bax和Bim在CVB3感染誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡早期發(fā)揮作用。

HeLa細(xì)胞;柯薩奇病毒B3;細(xì)胞凋亡;Bax蛋白;Bim蛋白

引起病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的病毒眾多，而以柯薩奇病毒 B3(coxsackievirus B3，CVB3)引起的病毒性心肌炎較常見［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，VMC的發(fā)病與病毒感染所造成的直接損傷和感染后引起的機(jī)體免疫紊亂有關(guān)［3-4］。近年研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的凋亡也參與了VMC的發(fā)生、發(fā)展［5-6］，認(rèn)為細(xì)胞凋亡也是VMC的發(fā)病機(jī)制之一。參與細(xì)胞凋亡的信號通路及基因家族有多種，Bcl-2家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，它具有雙重效應(yīng)，即具有促進(jìn)凋亡的作用，也起到抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)［7］，其中Bim和Bax屬于該家族促進(jìn)細(xì)胞凋亡成員。本研究以CVB3感染Hela細(xì)胞后，觀察促凋亡成員Bax和Bim mRNA和蛋白表達(dá)及變化，探討促凋亡因子在細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮作用。

材料和方法

1 材料與試劑

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所惠贈。CVB3 Nancy株由本實驗室保存?zhèn)鞔?］。采用微量法測定其半數(shù)組織感染量(TCID50)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由 Toyobo生產(chǎn);Trizol總RNA抽提試劑盒及胰蛋白酶由Gibco生產(chǎn);改良型RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清由Hyclone生產(chǎn);PCR Master Mix及Marker I購自北京天根生化科技有限公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;Bax和Bim蛋白多克隆抗體由Cell Signaling Technology生產(chǎn);蛋白裂解液及聚丙烯酰胺凝膠試劑購自北京碧云天生化科技有限公司。

2 主要方法

2.1 實驗分組 以2×108/L的密度將HeLa細(xì)胞均勻地接種于6孔板中，予10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁處于對數(shù)生長期時，以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓過夜，隨機(jī)設(shè)立對照組和病毒組。

2.2 CVB3感染HeLa細(xì)胞模型的建立 根據(jù)Reed-Muench法計算病毒滴度，選取2×100 TCID50病毒濃度(2×10-2)接種細(xì)胞。將6孔板中培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞按照上述實驗方法隨機(jī)設(shè)立對照組及病毒組。以無血清培養(yǎng)基漂洗2次，對照組加入1 mL含2%胎牛血清的病毒維持液，病毒組加入1 mL病毒液。將6孔板置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h之后棄去6孔板中所有液體，然后加入病毒維持液2 mL，分別于加入病毒后3 h、6 h、9 h、12 h和24 h觀察細(xì)胞病變效應(yīng)及提取RNA和蛋白。

2.3 RT-PCR檢測CVB3感染后HeLa細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 采用Trizol試劑盒提取CVB3感染后不同時點(diǎn)對照組與病毒組的總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.4 Western blotting檢測CVB3感染后HeLa細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 用蛋白裂解液在冰上裂解CVB3感染后不同時點(diǎn)對照組與病毒組的HeLa細(xì)胞，獲取全細(xì)胞裂解液，檢測蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，放入5%脫脂牛奶4℃冰箱封閉過夜，加Ⅰ抗置于勻速搖床孵育3 h后漂洗，然后加入脫脂牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫反應(yīng)2 h后漂洗，化學(xué)發(fā)光底物顯色，膠片曝光，掃描。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 CVB3感染HeLa細(xì)胞后Bax mRNA的表達(dá)

對照組內(nèi)不同時點(diǎn)比較，Bax mRNA的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);病毒組內(nèi)不同時點(diǎn)比較，Bax mRNA的表達(dá)量也無顯著差異(P＞0.05);對照組與病毒組比較，在3 h、6 h、9 h和12 h各時點(diǎn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但病毒組24 h Bax mRNA表達(dá)低于對照組(P＜0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.The mRNA expression of Bax in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖1 不同時點(diǎn)病毒組與對照組HeLa細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA的表達(dá)

表2 不同時點(diǎn)CVB3感染HeLa細(xì)胞對Bax mRNA表達(dá)的影響Table 2.The relative mRNA expression levels of Bax in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean± SD.n=4)

2 CVB3感染HeLa細(xì)胞后Bax蛋白的表達(dá)

對照組內(nèi)不同時點(diǎn)比較，Bax蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);病毒組Bax蛋白在24 h表達(dá)降低，與各時點(diǎn)比較差異顯著(P＜0.05)，而3 h、6 h、9 h和12 h各時點(diǎn)比較無顯著差異(P＞0.05);對照組與病毒組間比較，3 h、6 h、9 h和12 h時點(diǎn)Bax蛋白表達(dá)均無顯著差異(P＞0.05)，但病毒組24 h的Bax蛋白表達(dá)低于對照組(P＜0.05)，見圖2、表3。

Figure 2.The protein expression of Bax in control group and CVB3-infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖2 不同時點(diǎn)CVB3感染HeLa細(xì)胞及對照組細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白的表達(dá)

表3 不同時點(diǎn)CVB3感染HeLa細(xì)胞對Bax蛋白表達(dá)的影響Table 3.The protein levels of Bax in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean±SD.n=3)

3CVB3感染HeLa細(xì)胞后Bim mRNA的表達(dá)

對照組內(nèi)不同時點(diǎn)比較，Bim mRNA的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);病毒組內(nèi)不同時點(diǎn)比較，Bim mRNA的表達(dá)量差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);對照組與病毒組間比較，3 h、6 h、9 h和12 h時點(diǎn)無顯著差異(P＞0.05)，但24 h時點(diǎn)病毒組Bim mRNA表達(dá)低于對照組(P＜0.05)，見圖3、表4。

Figure 3.The mRNA expression of Bim in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖3 不同時點(diǎn)病毒組與對照組HeLa細(xì)胞內(nèi)Bim mRNA的表達(dá)

表4 不同時點(diǎn)CVB3感染HeLa細(xì)胞及對Bim mRNA表達(dá)的影響Table 4.The relative mRNA expression levels of Bim in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean±SD.n=4)

4 CVB3感染HeLa細(xì)胞后Bim蛋白的表達(dá)

對照組內(nèi)不同時點(diǎn)比較，Bim蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);病毒組3 h與6 h、及9 h與12 h時點(diǎn)比較均無顯著差異(P＞0.05)，3 h和6 h Bim蛋白表達(dá)均較9 h、12 h和24 h高(均P＜0.05)，24 h的Bim蛋白表達(dá)較9 h和12 h明顯降低(P＜0.05);對照組與病毒組比較，3 h和6 h的Bim蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，在9 h、12 h和24 h Bim蛋白表達(dá)較對照組降低(P＜0.05)，尤以24 h時點(diǎn)下降明顯，見圖4、表5。

Figure 4.The protein expression of Bim in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖4 不同時點(diǎn)病毒組與對照組HeLa細(xì)胞內(nèi)Bim蛋白的表達(dá)

表5 不同時點(diǎn)CVB3感染HeLa細(xì)胞對Bim蛋白表達(dá)的影響Table 5.The protein expression of Bim in CVB3-infected HeLa cells and the control cells at different time points(Mean±SD.n=3)

討論

VMC是由嗜心肌病毒感染引起的以局限性或彌散性心肌炎癥病變?yōu)橹鞯募膊?，是兒科臨床較常見的心血管疾病之一，近年來其發(fā)病率有所上升［9］。病毒感染不但可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，還可激活如Bcl-2家族、caspase家族等啟動心肌細(xì)胞凋亡，致心肌細(xì)胞損傷、心功能減退，并且心肌損傷程度和病毒毒力有關(guān)。細(xì)胞凋亡與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［10］，在人類正常的心臟中可以出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡的異常在心血管疾病的發(fā)病中也起著重要作用［11］，如心肌病、冠心病及高血壓病等。研究報道心肌炎患者心肌細(xì)胞中存在細(xì)胞凋亡異常，提示凋亡可能是心肌損害的機(jī)制之一。后來陸續(xù)證實細(xì)胞凋亡參與VMC的發(fā)生與發(fā)展［5，12-14］。

Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的家族，在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［15］，根據(jù)其作用機(jī)制可分為兩類:一類抗凋亡成員包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等;另一類促凋亡成員包括Bax、Bad、Bim等［7］?？沟蛲雠c促凋亡成員協(xié)同作用，在凋亡過程中發(fā)揮開關(guān)效應(yīng)。Bax是Bcl相關(guān)X蛋白，廣泛表達(dá)于心臟等各種組織中，過度表達(dá)可加速細(xì)胞凋亡。Bax不但有拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且可直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。韓波等［16］發(fā)現(xiàn)CVB3感染心肌細(xì)胞后可使心肌細(xì)胞過量表達(dá)Bax，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。曾婭莉等［17］發(fā)現(xiàn)Bax mRNA表達(dá)在辛伐他汀干預(yù)K562細(xì)胞24 h后隨時間的延長其表達(dá)增高。本研究發(fā)現(xiàn)，CVB3感染HeLa細(xì)胞后Bax mRNA表達(dá)在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各時點(diǎn)均有表達(dá)，且24 h內(nèi)Bax mRNA表達(dá)無增強(qiáng)或減弱的變化。同時通過觀察到CVB3感染HeLa細(xì)胞后Bax蛋白在各時點(diǎn)均有表達(dá)，在3 h、6 h、9 h和12 h Bax蛋白表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)，至24 h蛋白表達(dá)明顯下降，與各時點(diǎn)比較有顯著差異(P＜0.05)。在病毒組Bax蛋白的表達(dá)中，12 h內(nèi)Bax蛋白表達(dá)不隨時間的延長而變化，但在24 h蛋白表達(dá)明顯減弱，表明Bcl-2促凋亡成員Bax在病毒感染后的早期即促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，但隨病毒感染時間的延長，促凋亡效應(yīng)反而減弱，更證明Bcl-2家族凋亡成員的促凋亡作用在早期發(fā)揮作用。

Bim是一種與Bcl-2相互作用的僅含1個同源BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡基因，其可直接激活BH3域被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡起始的必需因子，可通過抑制死亡因子或啟動促凋亡蛋白功能，導(dǎo)致細(xì)胞色素C自線粒體向細(xì)胞漿的釋放，啟動caspase，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，也能以不依賴于細(xì)胞色素C的方式啟動caspase，如通過caspase啟動因子Apaf-1等來誘發(fā)細(xì)胞凋亡。曾有報道它可直接激活Bax和Bak，Bim缺失可觸發(fā)抗凋亡效應(yīng)［18］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在CVB3病毒感染后Bim mRNA表達(dá)在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各時點(diǎn)均有表達(dá)，且24 h內(nèi)Bim mRNA表達(dá)無增強(qiáng)或減弱的變化，與Bax mRNA變化趨勢基本一致。在病毒感染后Bim蛋白在各時點(diǎn)均有表達(dá)，呈逐漸下降的趨勢，最初的3 h和6 h Bim蛋白表達(dá)無明顯差異，9 h至12 h開始出現(xiàn)蛋白表達(dá)下降，但9 h與12 h無差異，至24 h Bim蛋白表達(dá)明顯下降，且24 h與各時點(diǎn)比較均有顯著差異。李小平等［19］發(fā)現(xiàn)，CVB3感染HeLa細(xì)胞4 h后細(xì)胞發(fā)生凋亡，呈時間依賴性增高，24 h后較多HeLa細(xì)胞出現(xiàn)凋亡改變，但在晚期凋亡細(xì)胞中可能存在壞死的細(xì)胞，導(dǎo)致促凋亡基因及蛋白表達(dá)降低。本實驗發(fā)現(xiàn)，CVB3病毒感染HeLa細(xì)胞后Bax和Bim mRNA在24 h內(nèi)各時點(diǎn)均有表達(dá)，但各時點(diǎn)間均無顯著差異(P＞0.05)。Bim蛋白表達(dá)在病毒感染早期較高，隨感染時間的延長出現(xiàn)逐漸下降趨勢，至24 h明顯下降，而Bax在12 h蛋白表達(dá)無顯著變化，至24 h明顯下降，可見Bax蛋白表達(dá)與Bim蛋白表達(dá)趨勢也基本一致，均是在24 h表達(dá)明顯減弱。

由此可知，在CVB3感染HeLa細(xì)胞模型中，Bcl-2家族促凋亡成員Bax和Bim均能發(fā)揮促凋亡作用，使HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，且均在病毒感染早期就開始發(fā)揮促凋亡作用，該作用貫穿細(xì)胞死亡的始終，只是隨病毒感染時間的延長，因其它促使細(xì)胞死亡的形式可能逐漸超過細(xì)胞凋亡的作用，而導(dǎo)致促凋亡因子的表達(dá)反而隨時間的延長出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，故提示促凋亡因子Bax和Bim在CVB3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。

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Expression of Bax and Bim in coxsackievirus B3-infected HeLa cells

YANG Li，LI Xin，TIAN Lang，HUANG Li-hua，LI Zhuo-ying，YANG Zuo-cheng
(Department of Pediatrics，Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410013，China.E-mail:yang_ zcr@126.com)

AIM:To observe the expression of Bax and Bim at mRNA and protein levels in coxsackievirus B3 (CVB3)-infected HeLa cells.METHODS:HeLa cells were divided into control(non-CVB3 infection)group and CVB3 infection group.The expression of Bim and Bax at mRNA and protein levels was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blotting analysis at 3 h，6 h，9 h，12 h and 24 h postinfection.RESULTS:The mRNA expression of Bax and Bim in control group was not significantly different among different time points，so was that in CVB3 infection group(all P＞0.05).However，compared with control group，the mRNA expression of Bax and Bim in CVB3 infection groups was decreased at 24 h postinfection(all P＜0.05).The protein expression of Bax and Bim in control group was not significantly different among different time points(P＞0.05).However，in CVB3 infection group，the protein expression of Bax was lower at 24 h postinfection than that at 3 h(P＜0.05).Meanwhile，compared with control group，the protein expression of Bax in CVB3 infection group was decreased at 24 h postinfection(P＜0.05).The protein expression of Bim in CVB3 infection groups was decreased along with the time postinfection，and was decreased at 9 h，12 h and 24 h as compared with control group(P＜0.05).CONCLUSION:The proteins of Bax and Bim play an important role in CVB3-induced apoptosis of HeLa cells.

HeLa cells;Coxsackievirus B3;Apoptosis;Bax protein;Bim protein

R725

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.024

1000-4718(2014)03-0524-05

2013-03-04

2014-01-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30973233);中南大學(xué)創(chuàng)新課題資助項目(No.2011ssxt196)

△通訊作者Tel:0731-88618205;E-mail:yang_zcr@126.com