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      雪膽素乙誘導(dǎo)刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究*

      2014-05-16 02:17:46施資堅(jiān)劉坤鵬尹良紅
      中國病理生理雜志 2014年3期
      關(guān)鍵詞:膜電位線粒體活化

      胡 波, 施資堅(jiān), 王 遙, 劉坤鵬, 潘 浩, 尹良紅△

      (暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系,廣東廣州 510632)

      雪膽素乙誘導(dǎo)刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究*

      胡 波1, 施資堅(jiān)1, 王 遙2, 劉坤鵬2, 潘 浩2, 尹良紅1△

      (暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系,廣東廣州 510632)

      目的:分析雪膽素乙(CuIIb)對刀豆蛋白A(Con A)刺激的小鼠淋巴細(xì)胞體外凋亡的影響,并探討其作用機(jī)制。方法:以Annexin V染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠淋巴細(xì)胞凋亡情況;利用JC-1染色分析淋巴細(xì)胞線粒體膜電位變化;Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白變化。結(jié)果:CuIIb處理后,早期和中期凋亡細(xì)胞比例明顯增加,淋巴細(xì)胞線粒體膜電位降低。同時(shí),CuIIb以劑量依賴方式激活caspase-3凋亡通路并明顯降低抗凋亡蛋白survivin的表達(dá)。結(jié)論:CuIIb誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與其降低線粒體膜電位、激活caspase-3凋亡通路有關(guān)。

      雪膽素乙;淋巴細(xì)胞;刀豆蛋白A

      雪膽素乙(cucurbitacin II b,CuIIb)是從葫蘆科雪膽屬植物雪膽(Hemsleya amalils Diels)中提取的一種四環(huán)三萜類化合物,是葫蘆素家族的一個(gè)成員,化學(xué)名為23,24-雙氫葫蘆素F[1]。自古以來,我國西南各民族用雪膽治療菌痢、腸炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等炎癥相關(guān)疾病。作為民族藥,其具有清熱解毒、抗菌消炎的功效[2-3]。雪膽塊根中提取物制備為雪膽素片(含雪膽素甲和乙)已在臨床用于治療菌痢和腸炎等疾病,但其抗炎作用的機(jī)制尚不清楚。前文以刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)激活的小鼠淋巴細(xì)胞為模型[4],發(fā)現(xiàn)CuIIb能有效影響淋巴細(xì)胞體外活化、增殖以及炎癥因子的表達(dá),但分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究以體外活化的小鼠淋巴細(xì)胞為模型,分析了CuIIb對活化小鼠淋巴細(xì)胞凋亡的影響,探討其作用機(jī)制。

      材料和方法

      1 材料

      清潔級BALB/c小鼠,雌性,6~8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CuIIb (純度98%),購自上海順勃生物技術(shù)公司。Con A和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Sigma-Aldrich。RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、L-谷氨酰胺和β-巰基乙醇購自 Gibco/Invitrogen。5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazolcarbocyanine iodide(JC-1)和 RNase A購自Carlsbad。Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒購自Becton Dickinson。CuⅡb用DMSO配制成0.02 mol/L的儲存液,-20℃保存待用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、DNA雙鍵斷裂標(biāo)志物H2AX(γ-H2AX)、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶[poly-(ADP-ribose)polymerase,PARP]、Bcl-2、survivin等抗體均購自Cell Signaling。

      2 方法

      2.1 小鼠淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng) 頸髓脫臼處死小鼠,無菌分離小鼠頸部、腋下以及腹股溝淋巴結(jié),置于盛有預(yù)冷的PBS的無菌平皿中,除去被膜,以200目尼龍網(wǎng)濾過,收集的細(xì)胞用PBS洗滌2遍(1 500 r/min離心5 min),用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(25 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、50 μmol/L β-巰基乙醇和10%FBS)調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L,接種于24孔板中(每孔500 μL)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

      2.2 Annexin V-PE染色 收集不同濃度CuIIb處理24 h的淋巴細(xì)胞,用冷PBS洗2次,將細(xì)胞重懸于100 μL 1×結(jié)合緩沖液,加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD,25℃ 避光放置15 min,再加入300 μL的結(jié)合緩沖液,立即上機(jī)分析。

      2.3 JC-1染色檢測線粒體膜電位 各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24和48 h后,離心收集細(xì)胞,棄上清,用500 μL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,加入500 μL JC-1工作液,JC-1終濃度為2.5 mg/L,細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃ 避光孵育20 min,離心,棄上清,冷 PBS洗滌2次,再加入冷PBS 300 μL,重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測。

      2.4 免疫印跡 收集 CuIIb(5和10 μmol/L)處理24 h的小鼠淋巴細(xì)胞,用RIPA裂解細(xì)胞獲得總蛋白[5],隨后取適量樣品應(yīng)用BCA試劑盒測量蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠,每個(gè)樣品上樣40 μg蛋白,電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。將膜轉(zhuǎn)置5%脫脂牛奶室溫封閉1~2 h,TBS+Tween洗膜3×5 min。加入以5%BSA稀釋的I抗,置4℃搖床過夜。洗膜后再分別與相應(yīng)的II抗(5% 脫脂牛奶稀釋)室溫孵育1 h,洗膜3次。最后用BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天)顯色,X光片感光顯影,F(xiàn)luorChem 800 (Alpha Innotech)成像儀記錄結(jié)果并以Alpha EASE FC軟件分析結(jié)果。

      3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),用GraphPad Prism 4.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié)果

      1 CuIIb引起活化的淋巴細(xì)胞凋亡

      流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果見圖1,Con A刺激組凋亡細(xì)胞比例為39.92%,明顯低于對照組;而2.5、5和10 μmol/L CuIIb均能明顯增加凋亡細(xì)胞比例,與Con A組相比差異明顯,并具有劑量依賴性。

      2 CuIIb對小鼠淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的影響

      線粒體膜電位結(jié)果見圖2,CoA組線粒體膜電位明顯低于對照組(P<0.01);而與 Con A 組(37.96%)相比,Con A+10 μmol/L CuIIb組線粒體膜電位(45.29%)顯著上升 (P<0.05),而CuIIb濃度度為2.5和5 μmol/L時(shí)線粒體膜電位與CoA組差異不顯著。

      3 CuIIb促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞caspase-3的活化

      免疫印跡結(jié)果表明(圖3),藥物作用24 h后,10 μmol/L CuIIb能夠明顯促進(jìn)caspase-3活化(即產(chǎn)生cleaved caspase-3)和γ-H2AX水平升高,表明在激活的淋巴細(xì)胞內(nèi),雪膽素乙誘導(dǎo)了DNA損傷。另外,PARP上升幅度不高,抗凋亡蛋白Bcl-2未受雪膽素乙處理的影響,而細(xì)胞周期調(diào)控的凋亡抑制蛋白survivin水平顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明,雪膽素乙通過誘導(dǎo)DNA損傷、抑制survivin表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

      Figure 1.CuIIb induced apoptosis of Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P<0.01 vs control group;**P<0.01 vs Con A group.圖1 CuIIb引起活化的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡

      Figure 2.CuIIb induced cell apoptosis with reduced mitochondral membrane potential in Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean± SD.n=3.##P<0.01 vs control group;*P<0.05 vs Con A group.圖2 CuIIb對小鼠淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的影響

      Figure 3.Effects of CuIIb on the levels of cleaved caspase-3,PARP,phosphorylated H2AX(γ-H2AX),Bcl-2 and survivin in Con A-stimulated lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs Con A group.圖3 CuIIb對小鼠淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及survivin表達(dá)的影響

      討論

      淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮核心作用,淋巴細(xì)胞的活化、增殖及促炎因子的釋放等細(xì)胞行為是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)和關(guān)鍵事件,在免疫防御、免疫調(diào)節(jié)、炎癥發(fā)生及自身免疫疾病中都發(fā)揮重要作用。本研究表明CuIIb能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡,并可能與CuIIb以劑量依賴方式影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān),提示CuIIb抗炎可能與其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)。

      Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員,能直接抑制caspase-3和caspase-7的活性,阻斷細(xì)胞的凋亡過程。目前研究認(rèn)為可能是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的: survivin能與激活的caspase-3和caspase-7結(jié)合,阻止由 caspase激活劑或凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞DEVD-cleaving自殺酶的積累,抑制了caspase的級聯(lián)反應(yīng),從而阻止腫瘤細(xì)胞凋亡[6];survivin也可通過p21間接抑制caspase,其機(jī)制可能為survivin與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4形成survivin-CDK4復(fù)合體,使得p21從CDK4的復(fù)合體中釋放出來,p21進(jìn)一步與線粒體caspase-3結(jié)合,抑制其活性,阻止細(xì)胞凋亡[7]。我們的結(jié)果顯示在Con A刺激活化的T淋巴細(xì)胞中,雪膽素乙處理后,淋巴細(xì)胞抗凋亡蛋白survivin的下調(diào),促使caspase-3從復(fù)合體中釋放,從而進(jìn)一步提高其活化水平,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。

      線粒體在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用已經(jīng)被證實(shí)[8-10]。在特定凋亡誘導(dǎo)環(huán)境中,線粒體膜電位水平下調(diào),導(dǎo)致膜通透性增加,啟動(dòng)凋亡相關(guān)的細(xì)胞色素C釋放[11],線粒體膜電位水平下調(diào)與線粒體依賴性的早期凋亡相關(guān)。另外,當(dāng)DNA損傷發(fā)生,H2AX被快速磷酸化,并招募其它修復(fù)因子聚集在損傷部位,因此被作為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志[12-13]。本文結(jié)果顯示雪膽素乙處理細(xì)胞后會提高DNA雙鍵斷裂標(biāo)志物γ-H2AX的水平,表明在淋巴細(xì)胞中,雪膽素乙誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過刺激DNA雙鍵斷裂來實(shí)現(xiàn)的。同時(shí),體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞會發(fā)生自發(fā)性凋亡,因此未經(jīng)Con A刺激的淋巴細(xì)胞也表達(dá)較高水平的活化caspase-3和PARP。Con A刺激可使淋巴細(xì)胞增殖,因此ConA的刺激降低了淋巴細(xì)胞的自發(fā)凋亡。

      綜上所述,CuIIb能夠明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)Con A活化的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡,并通過CuIIb劑量依賴方式激活caspase-3凋亡通路并下調(diào)抗凋亡蛋白survivin表達(dá)。

      [1]聶瑞麟,陳宗蓮.雪膽屬植物化學(xué)研究歷史和現(xiàn)狀[J].云南植物研究,1986,8(1):115-124.

      [2]白 敏,李宏亮,徐貴麗.雪膽屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,33(1B): 177-180.

      [3]Jayaprakasam B,Seeram NP,Nair MG.Anticancer and antiinflammatory activities of cucurbitacins from Cucurbita andreana[J].Cancer Lett,2003,189(1):11-16.

      [4]王 遙,劉坤鵬,宋方茗,等.雪膽素乙對小鼠淋巴細(xì)胞體外活化及增殖的影響[J].免疫學(xué)雜志,2013,29 (3):190-194.

      [5]王 斌,李悅山.硫氧還蛋白硝基化在多柔比星誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用[J].中國病理生理雜志,2013,29(8):1358-1364.

      [6]Tamm I,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95),Bax,caspases and anticancer drugs[J].Cancer Res,1998,58(23):5315-5320.

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      [11]Wang H,Liu H,Zheng ZM,et al.Role of death receptor,mitochondrial and endoplasmic reticulum pathways in different stages of degenerative human lumbar disc[J].Apoptosis,2011,16(10):990-1003.

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      Cucurbitacin IIb induces apoptosis of concanavalin A-activated mouse lymphocytes

      HU Bo1,SHI Zi-jian,WANG Yao2,LIU Kun-peng2,PAN Hao2,YIN Liang-hong1
      (1Department of Nephrology,The First Affiliated Hospital,2Department of Immunobiology and Department of Cell Biology,College of Life Science and Technology,Jinan University,Guangzhou 510630,China.E-mail:yin-yun@126.com)

      AIM:To explore the potential anti-inflammatory effect and the underlying mechanism of cucurbitacin II b(CuIIb)on concanavalin A(Con A)-activated mouse lymphocytes.METHODS:The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V staining.The change of mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining.The levels of caspase-3,phosphorylated H2AX and survivin were detected by Western blotting.RESULTS:Compared with Con A-activated lymphocytes,the significant increases in the proportion of the cells with reduced mitochondrial membrane potential or with increased Annexin V staining were observed,reflecting increased apoptosis in CuIIb plus Con A-treated cells.The increased levels of activated caspase-3 and phosphorylated H2AX(a marker of double-stranded DNA breaks)were manifested in Con A-activated cells co-treated with CuIIb.Although only a slight difference of cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase was found in the cells with or without CuIIb treatment,the expression of survivin,an inhibitor of apoptosis protein,was markedly reduced by CuIIb in Con A-activated cells.CONCLUSION:CuIIb promotes apoptosis in mouse lymphocytes.

      Cucurbitacin II b;Lymphocytes;Concanavalin A

      R363

      A

      10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.021

      1000-4718(2014)03-0509-05

      2013-10-27

      2014-01-10

      科技部專項(xiàng)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(No.2006AA02Z4D8)

      △通訊作者Tel:020-38688502;E-mail:yin-yun@126.com

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