雪膽素乙誘導(dǎo)刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究*

胡 波， 施資堅(jiān)， 王 遙， 劉坤鵬， 潘 浩， 尹良紅△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系，廣東廣州 510632)

雪膽素乙誘導(dǎo)刀豆蛋白A刺激的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究*

胡 波1， 施資堅(jiān)1， 王 遙2， 劉坤鵬2， 潘 浩2， 尹良紅1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系，廣東廣州 510632)

目的：分析雪膽素乙(CuIIb)對刀豆蛋白A(Con A)刺激的小鼠淋巴細(xì)胞體外凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：以Annexin V染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠淋巴細(xì)胞凋亡情況;利用JC-1染色分析淋巴細(xì)胞線粒體膜電位變化;Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白變化。結(jié)果：CuIIb處理后，早期和中期凋亡細(xì)胞比例明顯增加，淋巴細(xì)胞線粒體膜電位降低。同時(shí)，CuIIb以劑量依賴方式激活caspase-3凋亡通路并明顯降低抗凋亡蛋白survivin的表達(dá)。結(jié)論：CuIIb誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與其降低線粒體膜電位、激活caspase-3凋亡通路有關(guān)。

雪膽素乙;淋巴細(xì)胞;刀豆蛋白A

雪膽素乙(cucurbitacin II b，CuIIb)是從葫蘆科雪膽屬植物雪膽(Hemsleya amalils Diels)中提取的一種四環(huán)三萜類化合物，是葫蘆素家族的一個(gè)成員，化學(xué)名為23，24-雙氫葫蘆素F［1］。自古以來，我國西南各民族用雪膽治療菌痢、腸炎、支氣管炎、急性扁桃體炎等炎癥相關(guān)疾病。作為民族藥，其具有清熱解毒、抗菌消炎的功效［2-3］。雪膽塊根中提取物制備為雪膽素片(含雪膽素甲和乙)已在臨床用于治療菌痢和腸炎等疾病，但其抗炎作用的機(jī)制尚不清楚。前文以刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)激活的小鼠淋巴細(xì)胞為模型［4］，發(fā)現(xiàn)CuIIb能有效影響淋巴細(xì)胞體外活化、增殖以及炎癥因子的表達(dá)，但分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究以體外活化的小鼠淋巴細(xì)胞為模型，分析了CuIIb對活化小鼠淋巴細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

清潔級BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CuIIb (純度98%)，購自上海順勃生物技術(shù)公司。Con A和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich。RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、L-谷氨酰胺和β-巰基乙醇購自 Gibco/Invitrogen。5，5＇，6，6＇-tetrachloro-1，1＇，3，3＇-tetraethyl-benzimidazolcarbocyanine iodide(JC-1)和 RNase A購自Carlsbad。Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒購自Becton Dickinson。CuⅡb用DMSO配制成0.02 mol/L的儲存液，-20℃保存待用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、DNA雙鍵斷裂標(biāo)志物H2AX(γ-H2AX)、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶［poly-(ADP-ribose)polymerase，PARP］、Bcl-2、survivin等抗體均購自Cell Signaling。

2 方法

2.1 小鼠淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng) 頸髓脫臼處死小鼠，無菌分離小鼠頸部、腋下以及腹股溝淋巴結(jié)，置于盛有預(yù)冷的PBS的無菌平皿中，除去被膜，以200目尼龍網(wǎng)濾過，收集的細(xì)胞用PBS洗滌2遍(1 500 r/min離心5 min)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(25 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、50 μmol/L β-巰基乙醇和10%FBS)調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L，接種于24孔板中(每孔500 μL)在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 Annexin V-PE染色 收集不同濃度CuIIb處理24 h的淋巴細(xì)胞，用冷PBS洗2次，將細(xì)胞重懸于100 μL 1×結(jié)合緩沖液，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD，25℃ 避光放置15 min，再加入300 μL的結(jié)合緩沖液，立即上機(jī)分析。

2.3 JC-1染色檢測線粒體膜電位 各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24和48 h后，離心收集細(xì)胞，棄上清，用500 μL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入500 μL JC-1工作液，JC-1終濃度為2.5 mg/L，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃ 避光孵育20 min，離心，棄上清，冷 PBS洗滌2次，再加入冷PBS 300 μL，重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 免疫印跡 收集 CuIIb(5和10 μmol/L)處理24 h的小鼠淋巴細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞獲得總蛋白［5］，隨后取適量樣品應(yīng)用BCA試劑盒測量蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，每個(gè)樣品上樣40 μg蛋白，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。將膜轉(zhuǎn)置5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h，TBS+Tween洗膜3×5 min。加入以5%BSA稀釋的I抗，置4℃搖床過夜。洗膜后再分別與相應(yīng)的II抗(5% 脫脂牛奶稀釋)室溫孵育1 h，洗膜3次。最后用BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天)顯色，X光片感光顯影，F(xiàn)luorChem 800 (Alpha Innotech)成像儀記錄結(jié)果并以Alpha EASE FC軟件分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，用GraphPad Prism 4.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 CuIIb引起活化的淋巴細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果見圖1，Con A刺激組凋亡細(xì)胞比例為39.92%，明顯低于對照組;而2.5、5和10 μmol/L CuIIb均能明顯增加凋亡細(xì)胞比例，與Con A組相比差異明顯，并具有劑量依賴性。

2 CuIIb對小鼠淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位結(jié)果見圖2，CoA組線粒體膜電位明顯低于對照組(P＜0.01);而與 Con A 組(37.96%)相比，Con A+10 μmol/L CuIIb組線粒體膜電位(45.29%)顯著上升 (P＜0.05)，而CuIIb濃度度為2.5和5 μmol/L時(shí)線粒體膜電位與CoA組差異不顯著。

3 CuIIb促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞caspase-3的活化

免疫印跡結(jié)果表明(圖3)，藥物作用24 h后，10 μmol/L CuIIb能夠明顯促進(jìn)caspase-3活化(即產(chǎn)生cleaved caspase-3)和γ-H2AX水平升高，表明在激活的淋巴細(xì)胞內(nèi)，雪膽素乙誘導(dǎo)了DNA損傷。另外，PARP上升幅度不高，抗凋亡蛋白Bcl-2未受雪膽素乙處理的影響，而細(xì)胞周期調(diào)控的凋亡抑制蛋白survivin水平顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，雪膽素乙通過誘導(dǎo)DNA損傷、抑制survivin表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Figure 1.CuIIb induced apoptosis of Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;＊＊P＜0.01 vs Con A group.圖1 CuIIb引起活化的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡

Figure 2.CuIIb induced cell apoptosis with reduced mitochondral membrane potential in Con A-stimulated mouse lymphocytes.Mean± SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs Con A group.圖2 CuIIb對小鼠淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 3.Effects of CuIIb on the levels of cleaved caspase-3，PARP，phosphorylated H2AX(γ-H2AX)，Bcl-2 and survivin in Con A-stimulated lymphocytes.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Con A group.圖3 CuIIb對小鼠淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及survivin表達(dá)的影響

討論

淋巴細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮核心作用，淋巴細(xì)胞的活化、增殖及促炎因子的釋放等細(xì)胞行為是免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)和關(guān)鍵事件，在免疫防御、免疫調(diào)節(jié)、炎癥發(fā)生及自身免疫疾病中都發(fā)揮重要作用。本研究表明CuIIb能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡，并可能與CuIIb以劑量依賴方式影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，提示CuIIb抗炎可能與其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，能直接抑制caspase-3和caspase-7的活性，阻斷細(xì)胞的凋亡過程。目前研究認(rèn)為可能是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的: survivin能與激活的caspase-3和caspase-7結(jié)合，阻止由 caspase激活劑或凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞DEVD-cleaving自殺酶的積累，抑制了caspase的級聯(lián)反應(yīng)，從而阻止腫瘤細(xì)胞凋亡［6］;survivin也可通過p21間接抑制caspase，其機(jī)制可能為survivin與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4形成survivin-CDK4復(fù)合體，使得p21從CDK4的復(fù)合體中釋放出來，p21進(jìn)一步與線粒體caspase-3結(jié)合，抑制其活性，阻止細(xì)胞凋亡［7］。我們的結(jié)果顯示在Con A刺激活化的T淋巴細(xì)胞中，雪膽素乙處理后，淋巴細(xì)胞抗凋亡蛋白survivin的下調(diào)，促使caspase-3從復(fù)合體中釋放，從而進(jìn)一步提高其活化水平，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。

線粒體在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用已經(jīng)被證實(shí)［8-10］。在特定凋亡誘導(dǎo)環(huán)境中，線粒體膜電位水平下調(diào)，導(dǎo)致膜通透性增加，啟動(dòng)凋亡相關(guān)的細(xì)胞色素C釋放［11］，線粒體膜電位水平下調(diào)與線粒體依賴性的早期凋亡相關(guān)。另外，當(dāng)DNA損傷發(fā)生，H2AX被快速磷酸化，并招募其它修復(fù)因子聚集在損傷部位，因此被作為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志［12-13］。本文結(jié)果顯示雪膽素乙處理細(xì)胞后會提高DNA雙鍵斷裂標(biāo)志物γ-H2AX的水平，表明在淋巴細(xì)胞中，雪膽素乙誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過刺激DNA雙鍵斷裂來實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞會發(fā)生自發(fā)性凋亡，因此未經(jīng)Con A刺激的淋巴細(xì)胞也表達(dá)較高水平的活化caspase-3和PARP。Con A刺激可使淋巴細(xì)胞增殖，因此ConA的刺激降低了淋巴細(xì)胞的自發(fā)凋亡。

綜上所述，CuIIb能夠明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)Con A活化的小鼠淋巴細(xì)胞凋亡，并通過CuIIb劑量依賴方式激活caspase-3凋亡通路并下調(diào)抗凋亡蛋白survivin表達(dá)。

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Cucurbitacin IIb induces apoptosis of concanavalin A-activated mouse lymphocytes

HU Bo1，SHI Zi-jian，WANG Yao2，LIU Kun-peng2，PAN Hao2，YIN Liang-hong1
(1Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital，2Department of Immunobiology and Department of Cell Biology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510630，China.E-mail:yin-yun@126.com)

AIM:To explore the potential anti-inflammatory effect and the underlying mechanism of cucurbitacin II b(CuIIb)on concanavalin A(Con A)-activated mouse lymphocytes.METHODS:The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V staining.The change of mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining.The levels of caspase-3，phosphorylated H2AX and survivin were detected by Western blotting.RESULTS:Compared with Con A-activated lymphocytes，the significant increases in the proportion of the cells with reduced mitochondrial membrane potential or with increased Annexin V staining were observed，reflecting increased apoptosis in CuIIb plus Con A-treated cells.The increased levels of activated caspase-3 and phosphorylated H2AX(a marker of double-stranded DNA breaks)were manifested in Con A-activated cells co-treated with CuIIb.Although only a slight difference of cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase was found in the cells with or without CuIIb treatment，the expression of survivin，an inhibitor of apoptosis protein，was markedly reduced by CuIIb in Con A-activated cells.CONCLUSION:CuIIb promotes apoptosis in mouse lymphocytes.

Cucurbitacin II b;Lymphocytes;Concanavalin A

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.021

1000-4718(2014)03-0509-05

2013-10-27

2014-01-10

科技部專項(xiàng)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(No.2006AA02Z4D8)

△通訊作者Tel:020-38688502;E-mail:yin-yun@126.com