ILK siRNA對高糖刺激的人腎小管上皮細胞GSK-3β及β-catenin表達的影響*

閆 喆， 姚 芳， 張麗萍， 郝 軍， 吳海江， 段惠軍△

(河北醫(yī)科大學(xué)1第二醫(yī)院腎內(nèi)科，2病理教研室，河北 石家莊 050000)

ILK siRNA對高糖刺激的人腎小管上皮細胞GSK-3β及β-catenin表達的影響*

閆 喆1，2， 姚 芳2， 張麗萍1， 郝 軍2， 吳海江2， 段惠軍2△

(河北醫(yī)科大學(xué)1第二醫(yī)院腎內(nèi)科，2病理教研室，河北 石家莊 050000)

目的：探討高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中整合素連接激酶小干擾RNA(ILK siRNA)對糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)磷酸化和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)核內(nèi)表達的影響及意義 。方法：體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞系HKC，分為正常對照組(NG)、高糖組(HG)、高糖+陰性轉(zhuǎn)染對照組(HG+HK)和高糖+ILK siRNA組(HG+ILK siRNA)。倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達。RT-PCR及Western blotting檢測ILK mRNA及蛋白表達水平;免疫細胞化學(xué)檢測磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)和β-catenin表達。Western blotting檢測總GSK-3β、p-GSK-3β、核β-catenin、總β-catenin、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達水平。結(jié)果：(1)倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達，證實構(gòu)建的siRNA重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染HKC細胞;(2)與HG和HG+ HK組相比，HG+ILK siRNA組ILK mRNA及蛋白水平下降，但較NG組表達仍高;(3)HG+ILK siRNA組ILK基因沉默后，p-GSK-3β與核β-catenin蛋白表達較HG及HG+HK組均下降，但較NG組表達仍高。而總GSK-3β與總β-catenin在各組表達無明顯差異。結(jié)論：ILK、GSK-3β和β-catenin可能參與了高糖介導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程。ILK可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑下游效應(yīng)蛋白GSK-3β和β-catenin的表達而促使腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化。

糖尿病腎病;上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化;整合素連接激酶;小干擾RNA;糖原合成酶激酶3β;β-連環(huán)蛋白

近年研究發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化程度與糖尿病腎病腎功能下降密切相關(guān)［1］。腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化是腎小管間質(zhì)纖維化的重要因素。整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)是腎小管間質(zhì)損傷及纖維化最強誘導(dǎo)因子之一［2］。有關(guān)腫瘤研究表明ILK可通過抑制糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)活性、影響β-連環(huán)蛋白(βcatenin)核聚集而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［3］。而GSK-3β與β-catenin均為Wnt/β-catenin途徑下游效應(yīng)蛋白。在腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中 ILK與Wnt/β-catenin途徑的關(guān)系尚未見報道。本研究利用ILK siRNA轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細胞沉默ILK基因，觀察ILK、GSK-3β和β-catenin表達水平變化，以探討三者在糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化中的作用及相互關(guān)系。

材料和方法

1 材料

人近端腎小管上皮細胞系HKC(解放軍總醫(yī)院陳香美教授惠贈)。D-葡萄糖 (Sigma)，小鼠抗ILK單克隆抗體、兔抗GSK-3β多克隆抗體、小鼠抗βcatenin單克隆抗體和兔抗 E-cadherin多克隆抗體(Santa Cruz)。兔抗p-GSK-3β多克隆抗體(Cell Signalling)，小鼠抗α-SMA單克隆抗體(Abcam)。RTPCR試劑(Promega)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔和羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司。核蛋白內(nèi)參照兔抗組蛋白H1多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司。pGenesil-1.1-HK質(zhì)粒、pGenesil-1.1-ILK siRNA質(zhì)粒和帶有pGenesil-1.1-ILK siRNA質(zhì)粒的DH5α大腸桿菌菌株(武漢晶賽公司)

2 方法

2.1 ILK siRNA轉(zhuǎn)染及篩選 質(zhì)粒pGenesil-1.1-ILK siRNA-1、pGenesil-1.1-ILK siRNA-2和pGenesil-1.1-ILK siRNA-3，是針對ILK基因(NM_001014795) 3個不同位點設(shè)計的帶短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA，經(jīng)酶切鑒定及測序證明質(zhì)粒均符合設(shè)計要求。ILK siRNA-1:5’-GGGGCACGGATCAATGTAA-3’，ILK siRNA-2: 5’-GTACAAGGCAGACATCAAT-3’，ILK siRNA-3: 5’-GACATGACTGCCCGAATTA-3’。HKC細胞共分6組:正常對照(normal glucose，NG)組、高糖(high glucose，HG)組、高糖+陰性轉(zhuǎn)染對照(HG+pGenesil-1.1-HK，HG+HK)組、高糖+pGenesil-1.1-ILK siRNA-1(HG+ILK siRNA-1)組、高糖+pGenesil-1.1-ILK siRNA-2(HG+ILK siRNA-2)組和高糖 + pGenesil-1.1-ILK siRNA-3(HG+ILK siRNA-3)組。

2.2 質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(按照LipofectamineTM2000說明書步驟):HKC細胞按 1× 108/L濃度傳于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長至細胞板80%時棄培養(yǎng)基，每孔中加入DMEM無血清培養(yǎng)液。將10 μL LipofectamineTM2000用 250 μL無血清DMEM稀釋，混勻后室溫下孵育5 min。取4個離心管中各加入250 μL無血清DMEM培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)粒 pGenesil-1.1-HK、pGenesil-1.1-ILK siRNA-1、pGenesil-1.1-ILK siRNA-2和 pGenesil-1.1-ILK siRNA-3各 4 μg混勻。將質(zhì)粒加入 LipofectamineTM2000稀釋液中，質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為1∶2.5混勻，室溫下孵育20 min。將上述DNA-脂質(zhì)體混合物分別加入6孔細胞培養(yǎng)板中，輕搖培養(yǎng)板，充分混勻。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。6 h后棄培養(yǎng)液，換10%無雙抗正?；蚋咛荄MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達，計算轉(zhuǎn)染效率。提取蛋白及RNA。

2.3 RT-PCR和Western blotting 檢測轉(zhuǎn)染細胞中ILK mRNA及蛋白表達，篩選敲低效果最明顯的ILK-siRNA。

2.3.1 RT-PCR 按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，利用Primers軟件設(shè)計目的基因引物，由上海生工公司合成。ILK上、下游引物分別為5’-ACT GGA TGC CGT ATG GAT-3’和5’-TGT CTG CTG AGC GTC TGT-3’，擴增片段為315 bp;GAPDH上、下游引物分別為5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’和5’-CTG TGC CGT TGA ACT TGC-3’，擴增片段為140 bp;擴增條件為:預(yù)變性94℃ 3 min，進入循環(huán)，95℃ 45 s，54℃ 80 s，72℃ 60 s，32個循環(huán)后72℃8 min。將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，置于凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP公司)進行吸光度掃描，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。

2.3.2 Western blotting PBS洗2遍細胞，加入細胞裂解液，冰浴1 h，4℃、12 000 r/min離心20 min，提取細胞總蛋白。取細胞裂解蛋白50 μg，經(jīng) SDSPAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入小鼠抗ILK單克隆抗體4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的抗小鼠抗體(1∶5 000稀釋)，37℃孵育2 h;洗膜后加ECL試劑，然后將PVDF膜放入X光片暗盒，壓片，顯影，定影。用UVP公司LabWorks 4.5軟件對Western blotting條帶進行定量分析。

2.4 根據(jù)篩選結(jié)果調(diào)整細胞分組 正常對照(NG，葡萄糖濃度5.5 mmol/L)組、高糖(HG，葡萄糖濃度30 mmol/L)組、高糖+pGenesil-1.1-HK(HG+HK)組和高糖+pGenesil-1.1-ILK siRNA-3(HG+ILK siRNA-3)組。

2.4.1 免疫細胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染細胞p-GSK-3β和β-catenin表達 按實驗分組刺激48 h。2%的多聚甲醛固定細胞，1%H2O2甲醇室溫孵育滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.1%Triton X-100孵育20 min，10%正常山羊血清封閉。加入兔抗p-GSK-3β多克隆抗體(1∶50)和小鼠抗β-catenin單克隆抗體(1∶50)，PBS為陰性對照，4℃過夜。滴加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠、羊抗兔抗體(1∶50)，DAB顯色。顯微鏡觀察、拍照，采用HPIAS-1000彩色病理圖文系統(tǒng)進行定量分析。p-GSK-3β以胞漿染色為陽性，選取5個不同視野(×200)，計算單位面積陽性染色區(qū)域平均積分吸光度。β-catenin計數(shù)陽性細胞核占一個視野總細胞核的百分比。

2.4.2 Western blotting檢測轉(zhuǎn)染48 h細胞中總GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、E-cadherin和 α-SMA表達 方法同上，核蛋白依據(jù)試劑盒說明書提取。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件統(tǒng)計，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 轉(zhuǎn)染HKC后綠色熒光蛋白表達

pGenesil-1.1-ILK siRNA-1、pGenesil-1.1-ILK siRNA-2和pGenesil-1.1-ILK siRNA-3轉(zhuǎn)染HKC細胞24 h倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白表達，48 h表達量明顯增多。這證實構(gòu)建的pGenesil-1.1-ILK siRNA-1、pGenesil-1.1-ILK siRNA-2和pGenesil-1.1-ILK siRNA-3重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染HKC細胞并能夠表達綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染效率可達60～70%，見圖1。

Figure 1.The fluorescent image of GFP protein expression in HKC cells transfected with ILK siRNA(×200).A:pGenesil-1.1-ILK siRNA-1;B:pGenesil-1.1-ILK siRNA-2;C:pGenesil-1.1-ILK siRNA-3.圖1 腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)染ILK siRNA后綠色熒光蛋白的表達

2HKC轉(zhuǎn)染3個ILK siRNA后ILK mRNA及蛋白的表達

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果 與 HG+HK組相比，pGenesil-1.1-ILK siRNA-1、pGenesil-1.1-ILK siRNA-2和pGenesil-1.1-ILK siRNA-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見 ILK mRNA水平下降，分別減少36.47%、25.11%及43.15%，但較NG組表達仍高，見圖2。這一結(jié)果表明，pGenesil-1.1-ILK siRNA-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組ILK mRNA水平下降最為明顯。

2.2 Western blotting檢測結(jié)果 pGenesil-1.1-ILK siRNA-1、pGenesil-1.1-ILK siRNA-2、pGenesil-1.1-ILK siRNA-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均可引起ILK蛋白表達下降，分別比 HG+HK組減少 41.59%、29.78%和56.12%，但較NG組表達仍高，見圖3。這一結(jié)果表明，pGenesil-1.1-ILK siRNA-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組ILK蛋白水平下降最為明顯。

Figure 2.ILK mRNA expression in different groups detected by RT-PCR.1:NG group;2:HG group;3:HG+ pGenesil-1.1-HK group;4:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-1 group;5:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-2 group;6:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-3 group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 1;#P＜0.05 vs 2 or 3.圖2 各組腎小管上皮細胞ILK mRNA表達

Figure 3.ILK protein expression in different groups detected by Western blotting.1:NG group;2:HG group;3:HG +pGenesil-1.1-HK group;4:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-1 group;5:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-2 group;6:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-3 group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs 1;#P＜0.05 vs 2 or 3.圖3 各組腎小管上皮細胞ILK蛋白表達

3 轉(zhuǎn)染最佳敲低效果pGenesil-1.1-ILK siRNA-3后p-GSK-3β和β-catenin的表達

3.1 免疫細胞化學(xué)結(jié)果 pGenesil-1.1-ILK siRNA-3轉(zhuǎn)染HKC后，p-GSK-3β和核β-catenin表達比HG及HG+HK組表達下降，但較NG組表達仍高，見圖4、5和表1。

Figure 4.Immunocytochemistry of p-GSK-3β in HKC cells (×400).A:NG group;B:HG group;C:HG+ pGenesil-1.1-HK group;D:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-3 group.圖4 各組腎小管上皮細胞p-GSK-3β表達

Figure 5.Immunocytochemistry of nuclear β-catenin in HKC cells(×400).A:NG group;B:HG group;C:HG +pGenesil-1.1-HK group;D:HG+pGenesil-1.1-ILK siRNA-3 group.圖5 各組腎小管上皮細胞核內(nèi)β-catenin表達

3.2 Western blotting結(jié)果 pGenesil-1.1-ILK siRNA-3轉(zhuǎn)染HKC細胞后p-GSK-3β、核β-catenin及α-SMA均較HG及HG+HK組表達下降，但較NG組表達仍高?？侴SK-3β與總β-catenin在各組表達無明顯差異。E-cadherin在HG+ILK siRNA-3組的表達較HG及HG+HK組有所升高，但較NG組表達仍低，見圖6。

表1 免疫組化檢測HKC細胞轉(zhuǎn)染ILK siRNA后p-GSK-3β及核β-catenin蛋白表達Table 1.The expression of p-GSK-3β and nuclear β-catenin in HKC cells transfected with ILK siRNA detected by immunocytochemistry(Mean±SD.n=6)

討論

腎小管間質(zhì)纖維化與腎功能下降密切相關(guān)［4］。ILK與慢性腎臟病腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化以及腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化等關(guān)系密切［5-6］。ILK是1996年Hammigan以整合素胞漿域為誘餌，運用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的一種細胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞-細胞外基質(zhì)連接處的重要分子骨架，對細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)具有調(diào)控作用［7］。ILK可通過多種途徑調(diào)節(jié)上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程。過度表達的外源性ILK導(dǎo)致上皮細胞E-鈣黏蛋白的丟失及α-平滑肌肌動蛋白的表達;導(dǎo)致纖維連接蛋白的表達和細胞外積聚;引起基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達和分泌增加，并增加細胞遷移和侵襲力等［8-9］。

Figure 6.The expression of p-GSK-3β，total GSK-3β，nuclear β-catenin，total β-catenin，E-cadherin and α-SMA in HKC cells transfected with ILK siRNA.Mean±SD.n=6.*P＜0.05;＊＊P＜0.01 vs NG;#P＜0.05 vs HG or HG+HK.圖6 各組腎小管上皮細胞p-GSK-3β、總GSK-3β、核β-catenin、總β-catenin、E-cadherin和α-SMA表達

GSK-3β與β-catenin均為Wnt/β-catenin途徑下游效應(yīng)蛋白。在Wnt/β-catenin信號途徑未激活情況下，GSK-3β可促使該途徑關(guān)鍵信號分子β-catenin泛素化后降解。Wnt/β-catenin途徑激活后，GSK-3β磷酸化而活性降低，β-catenin降解減少，打破了其原有的出入核平衡，細胞核內(nèi)的β-catenin大大增加，與轉(zhuǎn)錄因子淋巴樣增強子結(jié)合因子1/T細胞因子(lymphoid enhancer-binding factor 1/T-cell factor，LEF1/TCF)家族成員結(jié)合，促進 EMT的發(fā)生［10］。Wnt/β-catenin信號途徑不僅參與了腎臟的發(fā)育，在腎小球足細胞損傷中也發(fā)揮了作用［11］。

有研究表明ILK通過抑制GSK-3β活性而激活Wnt信號途徑，對于ILK與Wnt/β-catenin信號途徑關(guān)系的研究多集中于腫瘤的發(fā)病與進展中，ILK的過度表達可直接磷酸化GSK-3β(Ser9)而使其活性降低，使β-catenin降解減少而在胞漿與胞核內(nèi)聚集，誘導(dǎo)靶基因的表達，促使EMT發(fā)生，增強了腫瘤細胞的遷移力與侵襲力［12］。而且，ILK可調(diào)控胞核內(nèi)βcatenin/TCF/LEF1復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄活性，使細胞間黏附及細胞與細胞外基質(zhì)相互作用發(fā)生改變。同時，ILK可下調(diào)E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄表達也促使β-catenin由胞膜向胞核的重新分布［13-14］。因而ILK與Wnt信號途徑有交叉作用。但在腎小管轉(zhuǎn)分化及腎纖維化過程中二者的關(guān)系尚需進一步研究。本研究利用ILK siRNA轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細胞沉默ILK基因，發(fā)現(xiàn)HKC細胞轉(zhuǎn)染ILK siRNA后，ILK mRNA及蛋白表達均降低。GSK-3β磷酸化水平及胞核β-catenin表達較未轉(zhuǎn)染高糖組和陰性轉(zhuǎn)染對照組均降低。ILK siRNA能夠逆轉(zhuǎn)由高糖刺激的E-cadherin表達降低，同時下調(diào)α-SMA表達。據(jù)此認為ILK基因沉默后，改變了Wnt途徑下游因子GSK-3β和β-catenin的表達活性，一定程度上阻止了高糖誘導(dǎo)的腎小管細胞轉(zhuǎn)分化過程。

綜上所述，ILK可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑下游因子GSK-3β及β-catenin的表達，參與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程。本研究為進一步控制糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化進展提供了新的思路。

［1］Hills CE，Squires PE.The role of TGF-β and epithelial-to mesenchymal transition in diabetic nephropathy［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2011，22(3):131-139.

［2］Yan Q，Sui W，Xie S，et al.Expression and role of integrin-linked kinase and collagen IV in human renal allografts with interstitial fibrosis and tubular atrophy［J］.Transpl Immunol，2010，23(1-2):1-5.

［3］Bagnato A，Rosanò L.Epithelial-mesenchymal transition in ovarian cancer progression:a crucial role for the endothelin axis［J］.Cells Tissues Organs，2007，185(1-3):85-94.

［4］Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(2): 212-222.

［5］Li Y，Tan X，Dai C，et al.Inhibition of integrin-linked kinase attenuates renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(9):1907-1918.

［6］戴厚永，鄭 敏，湯日寧，等.厄貝沙坦對早期糖尿病腎病大鼠足細胞損傷及整合素連接激酶的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(11):2175-2179.

［7］Boulter E，Van Obberghen-Schilling E.Integrin-linked kinase and its partners:a modular platform regulating cellmatrix adhesion dynamics and cytoskeletal organization［J］.Eur J Cell Biol，2006，85(3-4):255-263.

［8］McPhee TR，McDonald PC，Oloumi A，et al.Integrinlinked kinase regulates E-cadherin expression through PARP-1［J］.Dev Dyn，2008，237(10):2737-2747.

［9］Cortez V，Nair BC，Chakravarty D，et al.Integrin-linked kinase 1:role in hormonal cancer progression［J］.Front Biosci(Schol Ed)，2011，3:788-796.

［10］Saito-Diaz K，Chen TW，Wang X，et al.The way Wnt works:components and mechanism［J］.Growth Factors，2013，31(1):1-31.

［11］周 靜，袁偉杰，謝院生，等.siRNA沉默WT1對小鼠足細胞Wnt/β-catenin和nephrin表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29(2):219-224.

［12］Joshi MB，Ivanov D，Philippova M，et al.Integrin-linked kinase is an essential mediator for T-cadherin-dependent signaling via Akt and GSK3β in endothelial cells［J］.FASEB J，2007，21(12):3083-3095.

［13］Bravou V，Klironomos G，Papadaki E，et al.ILK over-expression in human colon cancer progression correlates with activation of beta-catenin，down-regulation of E-cadherin and activation of the Akt-FKHR pathway［J］.J Pathol，2006，208(1):91-99.

［14］Engelman M de F，Grande RM，Naves MA，et al.Integrin-linked kinase(ILK)expression correlates with tumor severity in clear cell renal carcinoma［J］.Pathol Oncol Res，2013，19(1):27-33.

Role of ILK siRNA on expression of GSK-3β and β-catenin in human tubular epithelial cells stimulated by high glucose

YAN Zhe1，2，YAO Fang2，ZHANG Li-ping1，HAO Jun2，WU Hai-jiang2，DUAN Huijun2
(1Department of Nephrology，The Second Hospital，2Department of Pathology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China.E-mail:duanhj999@163.com)

AIM:To investigate the effects of siRNA targeting integrin-linked kinase(ILK)on the expression of glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β)and β-catenin during epithelial-mesenchymal transition(EMT)in human kidney proximal tubular epithelial cell line HKC induced by high glucose.METHODS:HKC cells were divided into 4 groups:normal glucose(NG)group，high glucose(HG)group，HG+HK(a vector containing the non-specific siRNA designed as negative control)group and HG+ILK siRNA group.The inverted fluorescence microscope was used to examine the expression of green fluorescent protein(GFP).The expression of ILK at mRNA and protein levels was detected by RTPCR and Western blotting.The expression of p-GSK-3β and β-catenin was observed by immunocytochemical staining.The protein expression of total GSK-3β，p-GSK-3β，nuclear β-catenin，total β-catenin，E-cadherin and α-smooth muscle actin (α-SMA)was measured by Western blotting.RESULTS:GFP was observed in HKC cells，indicating that the transfection was successful.Both the protein and mRNA of ILK were down-regulated in HG+ILK siRNA group compared with HG group and HG+HK group，but still higher than those in NG group.Silencing of ILK down-regulated the expression of p-GSK-3β and nuclear β-catenin.No difference of total GSK-3β or total β-catenin was observed among the 4 groups.CONCLUSION:These data support a functional role of ILK，GSK-3β and β-catenin in tubular EMT induced by high glucose.ILK may promote tubular EMT by regulating the activity of GSK-3β and β-catenin，the downstream effectors of the Wnt/βcatenin pathway.

Diabetic nephropathies;Epithelial-mesenchymal transition;Integrin-linked kinase;Small interfering RNA;Glycogen synthase kinase 3β;β-catenin

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.020

1000-4718(2014)03-0503-06

2013-10-10

2014-01-06

河北省衛(wèi)生廳課題(No.08282)

△通訊作者Tel:0311-86265724;E-mail:duanhj999@163.com