人參皂苷Rg1抑制叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷*

逯 丹， 舒曉明， 張嬋娟， 趙佳儀， 朱麗紅， 戚仁斌， 王華東， 陸大祥

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，暨南大學(xué)腦科學(xué)研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510632)

人參皂苷Rg1抑制叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷*

逯 丹▲， 舒曉明▲， 張嬋娟， 趙佳儀， 朱麗紅， 戚仁斌， 王華東， 陸大祥△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，暨南大學(xué)腦科學(xué)研究所，國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510632)

目的：觀察人參皂苷Rg1對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)誘導(dǎo)的原代大鼠皮層神經(jīng)元損傷的改善作用，并探討其可能機(jī)制。方法：將神經(jīng)元隨機(jī)分為正常對(duì)照組、10 μmol/L t-BHP組及10 μmol/L t-BHP+10 μmol/ L人參皂苷Rg1組，培養(yǎng)24 h。采用MTT檢測(cè)不同濃度t-BHP處理的神經(jīng)元活性，神經(jīng)元三維重建研究神經(jīng)元平均總纖維長(zhǎng)度及總突起數(shù)量，免疫熒光檢測(cè)caspase-3表達(dá)水平及免疫印跡方法檢測(cè)Bcl-2、caspase-3以及磷酸化糖原合成酶激酶3β(pGSK-3β)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：10 μmol/L人參皂苷Rg1能夠?qū)?0 μmol/L t-BHP引起的原代大鼠皮層神經(jīng)元活性水平的降低，并且上調(diào)Bcl-2及pGSK-3β蛋白表達(dá)量，降低caspase-3活化為cleaved caspase-3的水平(P＜0.05)。結(jié)論：人參皂苷Rg1可能通過(guò)提高GSK-3β自身磷酸化從而增強(qiáng)神經(jīng)元的抗t-BHP損傷能力。

人參皂苷Rg1;叔丁基過(guò)氧化氫;糖原合成酶激酶3β

人參是祖國(guó)傳統(tǒng)中藥的珍品，含有多種有效成分，具有延年益壽滋補(bǔ)強(qiáng)身的功效。研究證實(shí)人參有效成分對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能有改善作用，且人參皂苷Rg1具有促智作用，可以顯著改善腦缺血及淀粉樣多肽等損害引起的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，并對(duì)多種模型的學(xué)習(xí)記憶功能有保護(hù)作用［1］。人參皂苷Rg1作為人參藥理作用的主要成分之一，能夠提高機(jī)體內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化體系活性從而延緩衰老，長(zhǎng)期使用人參皂苷治療能防止老年小鼠失憶癥的發(fā)生，可改善記憶全過(guò)程［2］，人參皂苷Rg1作為益智藥的主要有效成分能夠促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放［3］、阻止腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程［4］等。本研究以叔丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)誘導(dǎo)建立原代神經(jīng)無(wú)損傷模型，觀察人參皂苷Rg1處理對(duì)t-BHP作用后細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及神經(jīng)突起變化，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初探。

材料和方法

1 動(dòng)物

新生24 h內(nèi)健康Sprague-Dawley大鼠乳鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為4402101947。

2 主要試劑

人參皂苷Rg1(純度≥96%)購(gòu)自廣東省藥品檢驗(yàn)所。DMEM/F12試劑培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone。Neurobasal購(gòu)自Invitrogen。B27購(gòu)自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自HyClone。胰蛋白酶、左旋多聚賴(lài)氨酸和MTT購(gòu)自Sigma。Caspase-3抗體、磷酸化糖原合成酶激酶3β(phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，pGSK-3β)抗體和Bcl-2抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。大鼠神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白2(microtubuleassociated protein 2，MAP-2)抗體購(gòu)自 Millipore。TRICT標(biāo)記山羊抗兔抗體以及FITC標(biāo)記的驢抗兔抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 原代大鼠皮層神經(jīng)元的的分離培養(yǎng) 用乙醇消毒新生鼠頭部后，斷頭處死，無(wú)菌條件下打開(kāi)顱腔，于PBS磷酸鹽緩沖液分離出皮層，去除腦膜和血管，稍靜置待組織沉入離心管底部，以上步驟均在4℃條件下進(jìn)行，靜止2 min后棄去上清，向組織內(nèi)加入0.125%胰蛋白酶，消化10 min后加入添加血清的培養(yǎng)基終止其消化，用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打至無(wú)可見(jiàn)的組織塊，組織懸液移至15 mL離心管進(jìn)行離心，離心5 min后棄去上清液，加入DMEM/ F12完全培養(yǎng)基(含10%FBS)用尖端拋光的玻璃管輕輕吹打數(shù)次，將吹打重懸后的沉淀通過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2× 107/L接種于培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種4 h后的細(xì)胞用原代神經(jīng)元Neurobasal完全培養(yǎng)基(含2%B27)全量換液。培養(yǎng)3 d后，原代神經(jīng)元完全培養(yǎng)基全量換液。

3.2 MAP2免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元并顯示其神經(jīng)纖維形態(tài) 棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1遍。用4%多聚甲醛溶液室溫固定神經(jīng)元20 min。PBS洗細(xì)胞2次。用0.1%Triton X-100室溫透化處理細(xì)胞10 min(24孔板每孔加入500 μL)。用0.1%BSA室溫封閉1 h。用封閉液中稀釋MAP-2 Ι抗至工作濃度，置于濕盒內(nèi)，4℃冰箱孵育過(guò)夜。除去Ι抗，用PBS洗3次(每次5 min)。圖4A為T(mén)RICT標(biāo)記的熒光Ⅱ抗臨用前用PBS稀釋至工作濃度，圖4 B為FITC標(biāo)記的熒光Ⅱ抗?jié)窈袃?nèi)室溫孵育Ⅱ抗30 min。除去Ⅱ抗，用PBS洗細(xì)胞3次(每次5 min)，加入500 μL PBS覆蓋后鏡下觀察，神經(jīng)纖維的三維重建通過(guò)Imaris software(BitPlane AG)檢測(cè)。

3.3 實(shí)驗(yàn)分組 (1)正常對(duì)照組:不加任何處理因素;(2)模型組:加入10 μmol/L t-BHP作用于原代皮層神經(jīng)元24 h;(3)人參皂苷Rg1保護(hù)處理組:加入10 μmol/L Rg1預(yù)保護(hù)4 h后再與10 μmol/L t-BHP共同作用于原代大鼠皮層神經(jīng)元24 h。

3.4 MTT法測(cè)細(xì)胞活性 原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞生長(zhǎng)5 d，用不同濃度t-BHP與人參皂苷Rg1對(duì)細(xì)胞處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，24 h后，用磷酸鹽緩沖液現(xiàn)配成初始濃度5 g/L的溶液，每孔加入100 μL MTT與培養(yǎng)基混合液，上述配液及加液過(guò)程需避光操作，之后置培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h，在預(yù)熱10 min的Bio-Rad酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度(absorbance，A)測(cè)定。根據(jù)下列公式計(jì)算各組細(xì)胞活性:細(xì)胞活性 =(A處理組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組) × 100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)細(xì)胞鋪板6孔板，按照先前的實(shí)驗(yàn)分組，加入不同的損傷及保護(hù)處理藥物后開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。達(dá)到作用時(shí)間后，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2次，每孔加入胰酶1 mL，放入培養(yǎng)箱消化3 min。輕輕吹打細(xì)胞使之懸浮于消化液中，在操作中要輕柔并且迅速，然后加含有血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。待細(xì)胞消化完全后，分組標(biāo)記，配平。將消化好的細(xì)胞放入離心機(jī)中，1 000 r/min離心×5 min。輕輕吸取上清，將不同組間加入loading buffer 200 μL。用槍頭吹打成單細(xì)胞懸液。然后在避光條件下加入PI及FITC染料各2 μL。避光反應(yīng)15 min。輕輕吹打混勻后，上級(jí)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

3.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)caspase-3的表達(dá) 棄去培養(yǎng)基，用PBS洗1遍。4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，加過(guò)氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶。正常山羊血清室溫孵育10 min后，加PBST(含0.5% Triton的PBS磷酸鹽緩沖液)稀釋caspase-3 Ι抗，抗體4℃孵育過(guò)夜。加TRICT標(biāo)記山羊抗兔IgG作用1 h，Hoechst 33342染核10 min后，洗片封片3次，每次5 min，顯微鏡下觀察并攝片。

3.7 免疫印跡法檢測(cè)Bcl-2、pGSK-3β和caspase-3表達(dá) 處理后的各組棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗2次，每孔加入60 μL細(xì)胞裂解液，冰面上裂解20 min，14 000×g、4℃離心10 min，取上清，Bradford法通過(guò)BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量(碧云天)。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉PVDF膜1 h后，分別加入相應(yīng)Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)于4℃ 孵育過(guò)夜，分別用相應(yīng)的抗兔或鼠Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液發(fā)光顯色，X線(xiàn)底片曝光。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用SPSS 13.0軟件包分析，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

結(jié)果

1 原代大鼠皮層神經(jīng)元鑒定

新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元采用無(wú)血清Neurobasal完全培養(yǎng)基(含2%B27)培養(yǎng)，以減少膠質(zhì)細(xì)胞的影響。培養(yǎng)5 d后，采用MAP-2免疫熒光染色對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，見(jiàn)圖1，可見(jiàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞80%以上都為神經(jīng)元，純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1.Neuron identification.Analysis of MAP-2 protein expression and Hoechst 33342 in primary rat cerebrocortical neurons by immuncytochemistry.圖1 原代大鼠皮層神經(jīng)元鑒定

2 人參皂苷Rg1對(duì)由t-BHP誘導(dǎo)的原代神經(jīng)元細(xì)胞損傷的活性影響

t-BHP對(duì)原代皮層神經(jīng)元損傷有濃度依賴(lài)性，見(jiàn)圖2A;10 μmol/L G-Rg1組處理24 h神經(jīng)元活性為95.24%，較模型組有顯著提高，見(jiàn)圖 2B(P＜0.05)，說(shuō)明人參皂苷Rg1在對(duì)抗t-BHP誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活性降低時(shí)具有較好的改善作用。

Figure 2.G-Rg1 inhibited t-BHP-induced decrease in the viability of primary rat cerebrocortical neurons.Cell viability was measured by MTT assay.A:effects of different concentrations of t-BHP on cell viability;B:effects of G-Rg1 on t-BHP-induced cell viability.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control(0 μmol/L t-BHP);#P＜0.05 vs 10 μmol/L t-BHP alone.圖2 人參皂苷Rg1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元活性的影響

3 人參皂苷 Rg1對(duì) t-BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響

如圖3所示，Q3區(qū)為正常細(xì)胞，Q2區(qū)為晚期凋亡細(xì)胞，Q4區(qū)為早期凋亡細(xì)胞。t-BHP損傷組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡有增加。10 μmol/L人參皂苷Rg1干預(yù)組凋亡細(xì)胞較t-BHP損傷組有降低。各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后，Hoechst 33324染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組細(xì)胞核光滑，形態(tài)較均勻一致，基本上沒(méi)有核固縮及核斷裂。損傷組與正常對(duì)照組相比較，可以觀察到大量神經(jīng)元細(xì)胞核體積明顯減小，有些細(xì)胞核形狀不規(guī)則，其中一些有染色質(zhì)濃縮、核固縮現(xiàn)象，邊緣化等典型的凋亡形態(tài)特征，凋亡細(xì)胞率損傷組較對(duì)照組有顯著增加。而人參皂苷Rg1組凋亡細(xì)胞率與 t-BHP損傷組相比較顯著降低，通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到有些細(xì)胞核體積縮小，有少量的核固縮，細(xì)胞核光滑，規(guī)則，基本均勻一致，少有核碎裂。對(duì)應(yīng)的t-BHP損傷組caspase-3平均每個(gè)視野達(dá)到60.6%，與正常對(duì)照組的14.6%比較，有顯著高表達(dá);而人參皂苷Rg1處理后的caspase-3顯著降低至36.4%，且與Hoechst 33324染色定位一致，見(jiàn)圖4 A～C，提示人參皂苷Rg1抑制的細(xì)胞凋亡可能通過(guò)抑制caspase-3表達(dá)進(jìn)行的。免疫印跡結(jié)果顯示，t-BHP損傷引起的原代皮層神經(jīng)元Bcl-2下調(diào)與caspase-3活化，經(jīng)人參皂苷Rg1處理的神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)量顯著升高，caspase-3活性顯著降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖4D、E。

Figure 3.G-Rg1 reduced t-BHP-induced apoptosis in primary neurons.圖3 人參皂苷Rg1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元凋亡的影響

4 人參皂苷Rg1提高神經(jīng)元突起的抗損傷能力

如圖5A所示，人參皂苷Rg1單獨(dú)作用的神經(jīng)纖維長(zhǎng)度為1 086.53 μm，與正常對(duì)照組的894.9 μm相比較有略微增長(zhǎng)，雖然無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但提示人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用可能與其維持神經(jīng)纖維生長(zhǎng)有關(guān)。按實(shí)驗(yàn)分組處理后，10 μmol/L t-BHP損傷后神經(jīng)纖維長(zhǎng)度(146.25 μm)較正常對(duì)照組(854.6 μm)有顯著損傷，而10 μmol/L t-BHP+ 10 μmol/L人參皂苷Rg1組的纖維總長(zhǎng)度(354.35 μm)較 10 μmol/L t-BHP損傷后神經(jīng)纖維長(zhǎng)度(146.25 μm)有所延長(zhǎng)(P＜0.05)，見(jiàn)圖5B～E。免疫印跡檢測(cè)顯示，10 μmol/L t-BHP+10 μmol/L人參皂苷Rg1組pGSK-3β蛋白較t-BHP單獨(dú)損傷組水平有增加(圖5E)，提示人參皂苷Rg1能夠通過(guò)pGSK-3β途徑穩(wěn)定神經(jīng)元纖維，從而抵抗t-BHP誘導(dǎo)的損傷。

討論

氧化損傷引起的過(guò)多神經(jīng)元丟失與神經(jīng)退行性疾病有密切關(guān)系［5］。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)元丟失多是由于凋亡通路被激活后誘發(fā)凋亡所致［6］。其中Bcl-2家族蛋白質(zhì)是線(xiàn)粒體凋亡途徑的主要調(diào)控因子，上調(diào)Bcl-2成為抑制神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞凋亡相關(guān)藥物的一類(lèi)重要靶標(biāo)。凋亡通路中一個(gè)重要的半胱氨酸蛋白酶成員caspase-3一直被認(rèn)為是凋亡發(fā)生的執(zhí)行者，實(shí)驗(yàn)證實(shí)caspase-3被抑制后細(xì)胞能夠抵抗來(lái)自多種損傷的凋亡［7-8］。同時(shí)，兩者是氧化損傷線(xiàn)粒體途徑的重要節(jié)點(diǎn)。人參皂苷Rg1在多種細(xì)胞中驗(yàn)證能夠減少細(xì)胞凋亡，例如Aβ1-42引起的PC12凋亡、MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡等等［9-10］。本實(shí)驗(yàn)用t-BHP建立原代皮層神經(jīng)元的衰老損傷模型，神經(jīng)元可呈現(xiàn)與凋亡有關(guān)的衰老的細(xì)胞特征:MTT法顯示細(xì)胞活性降低;免疫熒光顯示caspase-3活化細(xì)胞增多;Hoechst 33342染色顯示異常細(xì)胞核增多。而人參皂苷Rg1顯著減輕了以上的衰老變化。

Figure 4.Effects of G-Rg1 on the activation of caspase-3 and the expression of Bcl-2 in t-BHP-induced primary rat cerebrocortical neurons.A～C:the immunofluorescence images showed remarkable changes using antibodies against caspase-3.The arrowheads pointed to examples of apoptotic cells marked by high intensity of blue fluorescence and nuclear condensation.D and E:Western blotting showed the expression of Bcl-2，cleaved caspase-3 and caspase-3.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control(no treatment);#P＜0.05 vs t-BHP alone.圖4 人參皂苷Rg1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元caspase-3活化水平及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.Effect of G-Rg1 on the injuries of cerebrocortical neurons and pGSK-3β protein expression induced by t-BHP.A and B:neurons were treated with or without 10 μmol/L G-Rg1 for 24 h，and MAP-2 immunofluorescence staining was performed for quantitative analysis of total filament;C～E:neurons were treated with or without 10 μmol/L G-Rg1 and 10 μmol/L t-BHP，and their injuries were demonstrated using MAP-2 immunofluorescence staining;F:expression of pGSK-3β protein analyzed by Western blotting.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs control(no treatment);#P＜0.05 vs t-BHP alone.圖5 人參皂苷Rg1對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的大腦皮層神經(jīng)元損傷及p-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)形成必不可少的神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)，需要許多神經(jīng)纖維被同時(shí)激活，神經(jīng)元的纖維主要包括軸突樹(shù)突，因此神經(jīng)纖維的抗損傷能力越強(qiáng)，則越有利于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的維持，而人參皂苷Rg1具有促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生、增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶力、抗衰老、提高神經(jīng)可塑性的作用［11］，學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)可塑性方面的改善可能與其對(duì)神經(jīng)纖維的影響有關(guān)，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)以光鏡觀察及三維重建檢測(cè)神經(jīng)纖維長(zhǎng)度及形態(tài)在模型組有明顯損傷，而人參皂苷Rg1作用組神經(jīng)纖維長(zhǎng)度及形態(tài)有顯著改善，證明人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)有促進(jìn)作用從而使神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的建立、樹(shù)突軸突的成熟和穩(wěn)定趨于完善。與生存有關(guān)的GSK-3蛋白主要有兩種亞型，即GSK-3α和GSK-3β，GSK-3β還能作用于眾多信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控糖原合成酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡，而且活化的GSK-3β誘導(dǎo)tau蛋白的過(guò)度磷酸化，神經(jīng)纖維過(guò)度纏結(jié)，神經(jīng)元丟失，突觸丟失，同時(shí)抑制GSK3β高表達(dá)能夠穩(wěn)定細(xì)胞微管的結(jié)構(gòu)［12］。文獻(xiàn)報(bào)道 pGSK-3β是抑制GSK-3β活化的調(diào)節(jié)方式，因此人參皂苷Rg1作用的神經(jīng)元對(duì)抗t-BHP損傷與增加GSK-3β磷酸化有關(guān)。GSK3β本身能活化caspase-3，也可能是促使神經(jīng)元細(xì)胞損傷(或凋亡)的一個(gè)重要機(jī)制［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1組較t-BHP損傷組caspase-3蛋白活化的水平顯著降低，進(jìn)一步說(shuō)明人參皂苷Rg1能夠通過(guò)GSK-3β磷酸化升高而降低GSK-3β表達(dá)，從而抑制caspase-3的活化，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。另外，抑制GSK-3β，即磷酸化GSK-3β后，能夠激活蛋白酶B通路，最終使得Bcl-2上調(diào)，引起凋亡抵抗［15-16］。本研究亦發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1組較t-BHP損傷組Bcl-2蛋白水平顯著升高，細(xì)胞對(duì)抗t-BHP損傷的能力增強(qiáng)。

綜上所述，人參皂苷Rg1能夠通過(guò)磷酸化GSK-3β而抑制GSK-3β活性，從而在提高原代皮層神經(jīng)元抗衰老和抗損傷方面具有重要的意義，但其作用途徑及機(jī)制比較復(fù)雜，尚待進(jìn)一步研究。

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Ginsenoside Rg1 protects primary rat cerebrocortical neurons against t-BHP-induced damage in vitro

LU Dan，SHU Xiao-ming，ZHANG Chan-juan，ZHAO Jia-yi，ZHU Li-hong，QI Ren-bin，WANG Hua-dong，LU Da-xiang
(Department of Pathophysiology，Institute of Brain Research，Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

AIM:To observe the effect of ginsenoside Rg1(G-Rg1)on tert-butyl hydroperioxideo(t-BHP)-induced injury in primary rat cerebrocortical neurons and their filaments.METHODS:Primary rat cerebrocortical neurons were randomly divided into normal group，10 μmol/L t-BHP induction group and 10 μmol/L t-BHP+10 μmol/L G-Rg1 treatment group.The MTT assay was used to detect the cell viability under various concentrations of t-BHP.3D cell reconstruction was performed to measure the filament length and number.The protein expression levels of Bcl-2，phosphorylated glycogen synthase kinase 3β(pGSK-3β)and caspase-3 were determined by the methods of immunofluorescence and Western blotting.RESULTS:G-Rg1 at concentration of 10 μmol/L reversed the decrease in cell viability，increased the protein expression level of Bcl-2 and pGSK-3β，and suppressed the activation of caspase-3 in t-BHP induction group(P＜0.05).CONCLUSION:G-Rg1 increases the anti-stress ability of the neurons by increasing the pGSK-3β phosphoylation under the condition of t-BHP exposure.

Ginsenoside Rg1;Tert-butyl hydroperioxide;Glycogen synthase kinase 3β

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.017

1000-4718(2014)03-0479-07

2013-12-23

2014-01-20

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2011CB707501);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目重大專(zhuān)項(xiàng)(No.11BppZXaa2070006);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81371442)

△通訊作者Tel:020-85220004;E-mail:ldx@jnu.edu.cn

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