參麥注射液對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的干預作用及相關(guān)機制探討

王 巖， 郭永川， 梁前壘， 李朝暉， 董志恒△

(1北華大學病理學與病理生理學教研室，吉林吉林 132021;2吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科，吉林長春 130031)

參麥注射液對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的干預作用及相關(guān)機制探討

王 巖1， 郭永川2， 梁前壘2， 李朝暉2， 董志恒1△

(1北華大學病理學與病理生理學教研室，吉林吉林 132021;2吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科，吉林長春 130031)

目的：探討參麥注射液對糖尿病心肌病心肌纖維化的干預作用并初步探討其機制。方法：將30只Wistar大鼠分為對照組、糖尿病組以及治療組，每組各10只。采用鏈脲佐菌素單次腹腔注射的方法制作大鼠糖尿病模型，以枸櫞酸緩沖液腹腔注射為對照，治療組則采用腹腔注射的方式給予參麥注射液干預治療。采用心室插管對大鼠心功能進行評估;Masson染色觀察大鼠心臟組織中膠原水平;二氫乙啶染色觀察大鼠心臟組織中活性氧(ROS)水平;Western blotting觀察大鼠心肌組織中I型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)以及金屬蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)的表達水平。結(jié)果：與對照組相比，糖尿病組心功能顯著下降(P＜0.05);而治療組心功能則顯著恢復(P＜0.05)。與對照組相比，糖尿病組心肌組織ROS及膠原生成水平顯著升高(P＜0.05)，但經(jīng)參麥注射液治療后均顯著降低(P＜0.05)。與對照組相比，糖尿病組I型膠原及TIMP-2表達水平顯著升高(P＜0.05)，而MMP-2水平顯著降低(P＜0.05);與糖尿病組相比，治療組I型膠原及TIMP-2水平顯著降低(P＜0.05)，而MMP-2水平則顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論：參麥注射液可能通過抑制氧化應激損傷而減輕糖尿病心肌病心肌纖維化程度。

參麥注射液;糖尿病心肌病;纖維化;氧化性應激

心功能不全是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，以心肌肥 厚以及心肌纖維化為病理改變特征，心功能惡化常表現(xiàn)為心臟收縮、舒張功能的全面降低以及各種類型的心律失常。這種糖尿病所伴發(fā)的特異性心肌病被稱為糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［1］。目前研究表明，在體內(nèi)高糖環(huán)境下，葡萄糖對線粒體的持續(xù)氧化可導致體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產(chǎn)生，體內(nèi)氧化-還原平衡被破壞，進而激活基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)，后者在心肌纖維化、心臟重塑等病理變化中扮演重要的角色［2］。參麥注射液的主要成分為紅參及麥冬，具有補心復脈、養(yǎng)陰生津等功效，研究表明其具有一定的抗氧化活性［3］。本研究采用參麥注射液對DCM大鼠模型進行干預，探討其對DCM產(chǎn)生治療效果的機制。

材料和方法

1 動物分組及動物模型制作

選擇30只6周齡雄性Wistar大鼠作為實驗動物進行研究，體重190～220 g。實驗動物在22～25℃清潔級實驗室中進行分籠飼養(yǎng)，人工照明，12 h晝夜交替1次，大鼠均自由進食、飲水。將大鼠平均隨機分為3組，每組10只，分別為對照組、糖尿病組及治療組。采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射法制作糖尿病動物模型，STZ(溶解于pH 4.5 0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液中，制成1%STZ溶液)30 mg/kg進行單次腹腔注射，72 h后經(jīng)由尾靜脈取血，測血糖濃度≥16.7 mmol/L視為糖尿病動物模型建立成功。對照組則采用相同劑量的枸櫞酸緩沖液進行單次腹腔注射。治療組在糖尿病動物模型建立成功后，給予參麥注射液(每支10 mL，四川升和藥業(yè)股份有限公司)8 mL/kg腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射40 d。

2 觀察指標

2.1 心功能檢測 本研究心功能檢測采用左心室插管對大鼠心功能進行評估。使用器材包括Power-Lab 4/25型生物信息采集系統(tǒng)(AD Instruments);壓力換能器(Miller)。首先向大鼠尾靜脈內(nèi)注射肝素(0.3%，2 mg/kg)進行肝素化，然后使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，固定大鼠，頸正中切口鈍性分離出右頸總動脈，將遠心端活結(jié)結(jié)扎，鉗夾近心端后，將動脈壁剪開一個小口，插入與壓力換能器相連的導管，松開結(jié)扎線，將導管送入左心室，穩(wěn)定數(shù)分鐘后，測定大鼠的左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室壓力最大上升或下降速率(left ventricular pressure maximum rise/fall velocity，LV ±dp/dt)。

2.2 心肌組織ROS產(chǎn)生水平 采用脫頸法將大鼠處死，固定4肢，無菌打開胸腔，取出心臟，PBS中輕輕沖洗并擠出心腔內(nèi)的殘血，修剪心臟后置入液氮中速凍。速凍的組織使用 OCT冰凍切片包埋劑(Sakura)進行包埋后，在-20℃下制成厚度為10 μm的連續(xù)冰凍切片。采用二氫乙啶(dihydroethidium，DHE;10 μmol/L，碧云天生物技術(shù)研究所)對制成的冰凍切片在37℃下孵育45 min，熒光顯微鏡(Olympus)下進行觀察并采集圖片，并使用Image-Pro Plus 5.0軟件進行分析。

2.3 心肌組織Masson染色 將收集的心臟標本采用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后制成厚度為4 μm的石蠟切片。脫蠟后蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化，洗滌后用麗春紅酸性品紅溶液染色5 min，迅速水洗后在1%磷鉬酸中染色3 min，又在甲苯胺藍中染色5 min后水洗烘干，樹膠封片后觀察。采用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)對所得切片進行觀察并經(jīng)NIS-Elements BR軟件進行圖像采集。使用Image-Pro Plus軟件對獲得的圖片進行分析，計算膠原纖維染色面積占組織切片面積的分數(shù)，即膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)。

2.4 心肌組織I型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和金屬蛋白酶組織抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2)表達水平 用Western blotting對心肌組織中I型膠原、MMP-2以及TIMP-2蛋白表達水平進行檢測。在冰上將待測組織預冷，將組織剪碎，使用RIPA(Santa Cruz)懸浮組織，在冰上使用勻漿器對組織進行研磨，將勻漿液4℃下82 000 r/min離心45 min，留取上清蛋白，BCA法對獲得的蛋白濃度進行測定，向蛋白樣本中加入等量1×loading buffer，100℃變性5 min。將樣本進行SDS-PAGE電泳，將目的條帶電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，分別采用兔抗大鼠I型膠原(Abcam)、兔抗大鼠MMP-2 (Santa Cruz)以及兔抗大鼠TIMP-2(Santa Cruz)4℃孵育過夜。充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgGⅡ抗(工作濃度1∶5 000)室溫孵育2 h后進行充分洗滌，最后以Super Signal West Pico化學熒光發(fā)光試劑盒(Thermo)對檢測蛋白進行顯影，X膠片曝光后采用Image-Pro Plus 5.0軟件分析。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0軟件包分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異應比較采用單因素方差分析，以P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 各組大鼠心功能比較

與對照組相比，糖尿病組心功能明顯受損，表現(xiàn)為LVEDP顯著升高，同時LVSP和LV+dp/dt顯著降低(P＜0.05);而與糖尿病組相比，治療組心功能得到改善，表現(xiàn)為LVEDP降低，LVSP和LV±dp/dt顯著升高(P＜0.05)，見表1。

表1 各組左心室插管心功能檢測結(jié)果Table 1.Cardiac function detection in different groups by left ventricular intubation(Mean±SD.n=10)

2 各組大鼠心肌組織ROS水平比較

與對照組相比，糖尿病組大鼠心肌組織內(nèi)ROS生成水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而經(jīng)過參麥注射液處理的治療組，心肌組織內(nèi)ROS水平較糖尿病組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.DHE staining of cardiac tissue from each group(×200).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.圖1 各組大鼠心肌組織ROS生成水平比較

3 各組大鼠心肌組織膠原纖維染色

Masson染色見膠原纖維呈現(xiàn)藍染，正常細胞則呈現(xiàn)紅染。對照組心肌細胞排列整齊、致密，心肌細胞間少有膠原纖維;糖尿病組心肌細胞排列松散、紊亂，心肌細胞肥大、腫脹，心肌細胞間及血管周圍可見呈堆積狀分布的膠原纖維;治療組心肌細胞排列趨于整齊，腫脹減輕，且膠原纖維成分較糖尿病組明顯減少，見圖2。

4 各組大鼠心肌組織collagen I、MMP-2及TIMP-2表達

Western blotting發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病組collagen I及TIMP-2表達水平顯著升高(P＜0.05)，而MMP-2水平顯著降低(P＜0.05);與糖尿病組相比，治療組collagen I及TIMP-2水平顯著降低(P＜0.05)，而MMP-2水平則顯著升高(P＜0.05)，見圖3。

Figure 2.Masson staining of cardiac tissue in each group(×200).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色

討論

在當今社會，隨著生活水平的提高及生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年顯著升高的趨勢。糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并發(fā)癥，其發(fā)病與糖尿病的代謝紊亂相關(guān)，主要病理改變?yōu)樾募〖毎饣|(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積、心肌肥厚及心肌間質(zhì)纖維化等。其中心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要特征，心肌間質(zhì)中膠原大量沉著，能夠降低心臟順應性從而影響心臟的收縮及舒張功能［4］。本研究采用STZ單次腹腔注射的方法制作糖尿病模型，建模成功后采用左心室插管的方法對大鼠心功能進行評估。發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠LVEDP顯著升高，LVSP和LV ±dp/dt顯著降低，說明糖尿病大鼠出現(xiàn)心功能不全，可視為糖尿病心肌病。本研究還通過Masson染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量膠原堆積，進一步證實糖尿病心肌病伴隨心肌間質(zhì)的膠原堆積伴發(fā)心肌纖維化。

MMPs對ECM具有很強的降解作用，MMPs家族中MMP-2與MMP-9屬于明膠酶，在心肌組織中表達水平較高，是心肌內(nèi)抗纖維化的重要成分［5］。TIMPs也為內(nèi)源性，可對MMPs產(chǎn)生特異性抑制作用，該抑制活性通過其與MMPs共價結(jié)合實現(xiàn)，在TIMPs家族中，TIMP-2對MMPs的抑制作用最強。目前研究已經(jīng)證實，MMP-2表達水平的降低及TIMP-2表達水平的升高參與了糖尿病大鼠心肌纖維化的進程［6］。研究表明，高血糖狀態(tài)機體內(nèi)會堆積大量的ROS，后者會對正常組織造成氧化應激損傷。過量產(chǎn)生的ROS在體內(nèi)能夠通過增加核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等信號通路的活化程度，激活TIMPs/抑制MMPs，從而參與糖尿病心肌病纖維化的發(fā)病過程。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)ROS生成水平顯著增加，同時心肌組織膠原含量增加，MMP-2表達水平顯著降低，而TIMP-2表達水平顯著升高，從而說明MMP-2、TIMP-2參與糖尿病心肌纖維化的過程，但其具體機制仍有待深入探討。

Figure 3.Expression of collagen I，TMIP-2 and MMP-2 in cardiac tissue from each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.圖3 各組大鼠心肌組織I型膠原、MMP-2及TIMP-2的表達

參麥注射液有效成分來源于紅參及麥冬2味中藥，其有效成分人參皂苷具有清除自由基、抗氧化應激損傷的生物學活性。其中人參皂苷Rg1能夠提高體內(nèi)多種氧化酶的活性，人參皂苷Rb1則能夠通過改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇的分泌等維護體內(nèi)氧化-還原平衡［7］。本研究對糖尿病大鼠進行參麥注射液腹腔注射，能夠顯著改善糖尿病大鼠心功能。心臟DHE染色發(fā)現(xiàn)其心肌組織內(nèi)ROS水平較糖尿病大鼠顯著降低，Masson染色及I型膠原表達水平降低，表明心肌組織內(nèi)膠原含量顯著下降;同時發(fā)現(xiàn)與糖尿病大鼠相比，參麥注射液干預后能使其心肌組織內(nèi)MMP-2表達水平上升，其抑制劑TIMP-2表達水平下降。從以上結(jié)果不難看出，參麥注射液可能是通過其抗氧化活性抑制糖尿病心肌病纖維化的程度，可能通過激活MMPs/抑制TIMPs降低心肌組織膠原含量，從而發(fā)揮對糖尿病心臟的保護作用。

［1］黃婭茜，王 憲，孔 煒，等.糖尿病心肌病發(fā)病機制的研究進展［J］.生理科學進展，2010，41(1):31-36.

［2］崔 瑾，李德強，邱明才，等.環(huán)孢素A對鏈脲菌素誘導糖尿病大鼠心臟MMP-2和MMP-9表達的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26(3):238-240.

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Effects of Shenmai injection on myocardial fibrosis in rat model of diabetic cardiomyopathy

WANG Yan1，GUO Yong-chuan2，LIANG Qian-lei2，LI Zhao-hui2，DONG Zhi-heng1
(1Department of Pathology and Pathophysiology，Beihua University，Jilin 132021，China;2Department of Neurosurgery，China-Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130031，China.E-mail:liangqianlei169@sina.com)

AIM:To explore the effects of Shenmai injection on myocardial fibrosis in a rat model of diabetic cardiomyopathy(DCM).METHODS:Wistar rats(n=30)were randomly divided into control group，diabetes group and treatment group.Single intraperitoneal injection of streptozotocin was utilized to establish a rat model of DCM.The rats with DCM in treatment group were intraperitoneally injected with Shenmai injection.Ventricular cannulation was applied to assess the cardiac functions.The formation of collagen in the cardiac tissues was assessed by Masson staining.The generation of reactive oxygen species(ROS)in the cardiac tissues was detected by dihydroethidium staining.The expression levels of matrix metalloproteinase 2(MMP-2)，tissue inhibitor of metalloproteinase 2(TIMP-2)and collagen I in the cardiac tissues were determined by Western blotting.RESULTS:Compared with control group，the cardiac functions were deteriorated in diabetes group(P＜0.05)，which was improved in treatment group as compared with diabetes group(P＜0.05).Compared with control group，the formation of collagen and ROS increased significantly in diabetes group(P＜0.05)，which was decreased in treatment group as compared with diabetes group(P＜0.05).Compared with control group，the expression level of MMP-2 in the cardiac tissues was deceased and TIMP-2 was increased significantly in diabetes group(P＜0.05)，but reversed significantly in treatment group(P＜0.05).CONCLUSION:Shenmai injection attenuates cardiac fibrosis in the rats with DCM by inhibiting the generation of ROS.

Shenmai injection;Diabetic cardiomyopathies;Fibrosis;Oxidative stress

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.012

1000-4718(2014)03-0449-05

2013-08-08

2014-01-14

△通訊作者Tel:0431-84995981;E-mail:liangqianlei169@sina.com