柚皮苷通過抑制瘦素通路對抗高糖引起的心肌細胞損傷*

劉付貞， 陳景福， 潘德茂， 田麗紅， 郭潤民， 游 瓊， 吳 鏗△

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心內(nèi)科，廣東湛江524001;3中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)內(nèi)科，廣東廣州 510700)

柚皮苷通過抑制瘦素通路對抗高糖引起的心肌細胞損傷*

劉付貞1， 陳景福2， 潘德茂3， 田麗紅2， 郭潤民2， 游 瓊2， 吳 鏗2△

(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心內(nèi)科，廣東湛江524001;3中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)內(nèi)科，廣東廣州 510700)

目的：探討柚皮苷能否通過抑制瘦素通路保護H9c2心肌細胞，對抗高糖HG引起的損傷。方法：應(yīng)用Western blotting法檢測瘦素及瘦素受體(LEPR)的表達水平;細胞計數(shù)盒(CCK-8)測定細胞存活率;Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相測定凋亡細胞的形態(tài)及數(shù)量的變化;雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡照相法檢測胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;羅丹明123染色法測定線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果：應(yīng)用35 mmol/L葡萄糖(HG)處理H9c2心肌細胞6～24 h能上調(diào)瘦素表達，其中9 h時表達最多;HG處理心肌細胞1～24 h也能促進LEPR表達，其中12 h時表達最多;在HG處理心肌細胞前，80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h能明顯抑制HG對瘦素及LEPR表達的上調(diào)作用;柚皮苷預(yù)處理2 h、瘦素拮抗劑預(yù)處理24 h或瘦素受體拮抗劑預(yù)處理2 h均能抑制HG引起的心肌細胞損傷，使細胞存活率增多，凋亡細胞數(shù)量和胞內(nèi)ROS生成減少，MMP回升。結(jié)論：柚皮苷可通過抑制瘦素通路保護H9c2心肌細胞，對抗HG引起的損傷。

柚皮苷;瘦素;受體，瘦素;高血糖;心肌細胞

柚皮苷(naringin，NRG)，又稱柚甙、柑橘甙、異橙皮甙，是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于葡萄柚和酸橙等的果皮和果實中。此外，柚皮苷也是中藥化橘紅、骨碎補等的主要有效成份。越來越多的研究證實，柚皮苷具有涉及面較廣的藥理和治療作用，例如，抗氧化［1-2］、抗凋亡［3］、抗炎癥［1-2，4］和降血脂［2］等。此外，柚皮苷還具有心肌保護作用［3］及降血糖作用［5］。最近，我們證實，柚皮苷可通過抑制p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路保護心肌細胞對抗高糖引起的損傷［3］。另方面，有報道指出，p38 MAPK的上游信號分子瘦素(leptin)參與糖尿病引起的心肌細胞肥厚的發(fā)生［6］。但是，瘦素是否參與高糖引起的心肌細胞損傷(包括細胞毒性、凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體損傷)以及柚皮苷能否通過調(diào)控瘦素通路對抗高糖引起的心肌細胞損傷尚未明了。

瘦素是一種由脂肪細胞和其它細胞(如心肌細胞)釋放的分子量為16 kD的多肽，參與食欲與能量代謝的調(diào)節(jié)［7-8］。近年，不少的報道指出，瘦素也參與高血壓內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及心血管病患的發(fā)生［6，9-10］。瘦素是通過瘦素受體而產(chǎn)生生理與病理生理作用。瘦素受體有廣泛的組織分布，包括腎、胰腺、肺和心臟等［6，11］。但是，高糖及柚皮苷對瘦素受體表達有何影響迄今未見報道。

為了探討上述問題，本研究應(yīng)用35 mmol/L葡萄糖處理H9c2心肌細胞以建立高糖損傷心肌細胞模型［12］，旨在探討:(1)高糖處理心肌細胞不同時間對瘦素及其受體表達的影響;(2)柚皮苷對高糖誘導瘦素及其受體表達改變的影響;(3)柚皮苷能否通過調(diào)控瘦素-瘦素受體通路對抗高糖引起的心肌細胞損傷，為深入闡明高糖的心肌細胞損傷機制及柚皮苷的心肌保護機制提供新穎的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

Naringin、DCFH-DA、Hoechst 33258、羅丹明123 (rhodamine 123，Rh123)、瘦素拮抗劑(leptin antagonist，LA)和瘦素受體拮抗劑［leptin receptor(LEPR) antagonist，ObRa］購自Sigma-Aldrich;細胞計數(shù)試劑盒8(cell counter kit-8，CCK-8)購自Dojindo Lab(日本);DMEM-F12培養(yǎng)基購于Hyclone;特級胎牛血清(FBS)購自Gibco;抗leptin抗體和抗LEPR抗體購自Cell Signaling technology Inc;H9c2心肌細胞由中山大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) H9c2心肌細胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃的溫箱中培養(yǎng)。

2.2 實驗分組 實驗分為8組:(1)正常對照(control)組;(2)高糖(high glucose，HG)損傷組;(3) NRG預(yù)處理+高糖損傷組:80 μmol/L NRG作用于H9c2心肌細胞2 h，撤去，用PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖作用24 h;(4)LA預(yù)處理+高糖損傷組:50 μg/L LA作用于H9c2心肌細胞24 h，撤去，用PBS洗2次，接著35 mmol/L葡萄糖作用24 h;(5) ObRa預(yù)處理+高糖損傷組:25 μg/L ObRa作用于H9c2心肌細胞2 h，撤去，用PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖作用24 h;(6)NRG組:80 μmol/L NRG作用于H9c2心肌細胞2 h;(7)LA組:50 μg/L的LA作用于H9c2心肌細胞24 h;(8)ObRa組:25 μg/L ObRa作用于H9c2心肌細胞2 h。

2.3 Western blotting法檢測瘦素和瘦素受體蛋白的表達水平 將H9c2心肌細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%面積時，各實驗組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入裂解液，4℃靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，然后采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗 p-瘦素抗體(1∶1 000)和抗瘦素受體抗體(1∶1 000)，4℃過夜，然后用TBST洗3次(每次5 min)。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實驗重復5次。

2.4 細胞存活率的測定 將H9c2心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，心肌細胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實驗組經(jīng)不同的處理因素作用后，于每孔中加入10 μL CCK-8和90 μL DMEM-F12，輕搖，37℃孵育2.5 h，用酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔吸光度(A)。取5孔A值的平均數(shù)，按下列公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%。實驗重復5次。

2.5 Hoechst 33258核染色法測定細胞凋亡 將H9c2心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在細胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實驗組經(jīng)不同的處理因素作用后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛于4℃環(huán)境中固定10 min，PBS沖洗3次，加入含5 mg/L Hoechst 33258試劑，于37℃溫箱孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下(TE-2000;Nikon)攝片，染色質(zhì)呈均勻分布，核被染成均勻藍色的細胞被認為是正常的心肌細胞，如細胞核呈濃縮、碎裂的明亮藍色，細胞則被認為是凋亡的心肌細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。實驗重復5次。

2.6 細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的檢測 將H9c2心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實驗組經(jīng)不同的處理因素后，PBS沖洗 3次，用含 10 μmol/L的DCFH-DA染液于37℃溫箱中孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，用ImageJ 1.41軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。實驗重復5次。

2.7 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測定 Rh123是一種能夠被線粒體所吸收的熒光染料，線粒體對其攝取能力取決于其跨膜電位。根據(jù)熒光強度可以間接反映MMP的高低。將H9c2心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實驗組經(jīng)不同的處理因素作用后，用PBS沖洗3次，用10 μg/L Rh123的無血清培養(yǎng)基于37℃溫箱中孵育45 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh123的線粒體。用ImageJ 1.41軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。實驗重復5次。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，用LSD-t檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 高糖上調(diào)心肌細胞瘦素及其受體的表達水平

圖1A顯示，應(yīng)用35 mmol/L葡萄糖(高糖，high glucose，HG)處理6～24 h均能明顯促進H9c2心肌細胞瘦素的表達(P＜0.01)，其中處理9 h時，瘦素的表達達到最高峰。

圖1B顯示，應(yīng)用HG處理H9c2心肌細胞1～24 h也能明顯促進瘦素受體的表達(均P＜0.01)，其中處理12 h時，瘦素受體的表達增加最多。

Figure 1.High glucose(35 mmol/L，HG)up-regulated the expression levels of leptin(A) and leptin receptor (LEPR;B)in H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control group.圖1 高糖促進H9c2心肌細胞瘦素及其受體的表達水平

2 柚皮苷抑制高糖對心肌細胞瘦素及其受體表達的上調(diào)作用

圖2A顯示，應(yīng)用HG處理H9c2心肌細胞9 h能促進瘦素的表達水平，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在HG處理心肌細胞前，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h能明顯地抑制HG對瘦素表達的促進作用，與HG處理組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。單獨應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷處理心肌細胞2 h，對瘦素的基礎(chǔ)表達無明顯影響(P＞0.05)。

另外，由圖2B可見，HG處理H9c2心肌細胞12 h能顯著促進瘦素受體的表達(P＜0.01)，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h也能明顯阻斷HG對瘦素表達的上調(diào)作用，與HG處理組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。柚皮苷處理本身對H9c2心肌細胞對瘦素的基礎(chǔ)表達無明顯作用(P＞0.05)。

Figure 2.Naringin(NRG)inhibited high glucose(HG)-induced up-regulation of expression of leptin(A)and leptin receptor(LEPR;B)in H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group.圖2 柚皮苷抑制高糖對心肌細胞瘦素及其受體表達的促進作用

3 柚皮苷和瘦素通路抑制劑抑制高糖引起的心肌細胞毒性

圖3顯示，HG處理H9c2心肌細胞24 h產(chǎn)生明顯的細胞毒性，使細胞存活率降低至(51.60± 0.23)%，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但是，在HG處理心肌細胞前，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h能顯著對抗HG引起的細胞毒性，使細胞存活率升高至(72.50±1.20)%，與HG處理組比較，差異明顯(P＜0.05)。另一方面，與柚皮苷的抗HG心肌細胞毒性的作用相似，在HG處理心肌細胞前，分別應(yīng)用50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也能抑制HG引起的細胞毒性，使心肌細胞存活率分別升高(78.50±1.90)%和(81.60±2.10)%，與HG處理組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。單獨LA或ObRa預(yù)處理本身對H9c2心肌細胞不產(chǎn)生細胞毒性(P＞0.05)。

Figure 3.Both naringin(NRG)and the inhibitors of leptin pathway attenuated high glucose(HG)-induced cytotoxicity in H9c2 cardiac cells.LA:leptin antagonist; ObRa:leptin receptor antagonist.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG-treat group.圖3 柚皮苷及瘦素通路抑制劑對抗高糖引起的心肌細胞毒性

4 柚皮苷和瘦素通路抑制劑抑制高糖的致心肌細胞凋亡作用

Hoechst 33258核染色的測定結(jié)果(圖4)顯示，正常的H9c2心肌細胞染色質(zhì)均勻分布，表現(xiàn)為彌散均勻的低密度熒光。然而，應(yīng)用HG處理H9c2心肌細胞24 h后，細胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，即細胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光。但是，在HG處理心肌細胞前，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h則能明顯抑制HG對心肌細胞的致凋亡作用，使細胞凋亡率從(42.2±1.1)%(HG處理組)降低至(18.1±1.2)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與柚皮苷的抗凋亡作用相似，50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也分別使心肌細胞凋亡率降低至(17.3±0.9)%和(19.5±1.7)%(P＜0.01)。單獨用柚皮苷、LA或ObRa預(yù)處理本身不引起H9c2心肌細胞凋亡。

Figure 4.Both naringin(NRG)and the inhibitors of leptin pathway antagonized high glucose(HG)-induced apoptosis of H9c2 cardiac cells.LA:leptin antagonist;ObRa: leptin receptor antagonist.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖4 柚皮苷及瘦素通路抑制劑減輕高糖引起的心肌細胞凋亡

5 柚皮苷和瘦素通路抑制劑減輕高糖誘導的心肌細胞內(nèi)活性氧堆積

圖5顯示，HG作用于H9c2心肌細胞24 h可使胞內(nèi)DCFH的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI;能間接反映ROS水平)明顯增強，與正常對照組相比，差異顯著(P＜0.01)。但是，80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h可使胞內(nèi)ROS堆積減少，MFI從(31.9± 1.0)%(HG處理組)減少至(14.3±1.5)%(P＜0.01)。與柚皮苷對ROS生成的抑制作用相似，50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也能分別使 MFI減少至(15.7±2.1)%和(12.9± 1.8)%(均P＜0.01)。單獨柚皮苷、LA或ObRa預(yù)處理本身對胞內(nèi)ROS生成無明顯作用(P＞0.05)。

6 柚皮苷和瘦素通路抑制劑減輕高糖引起的心肌細胞線粒體膜電位下降

圖6顯示，HG作用H9c2心肌細胞24 h使胞內(nèi)Rh123的MFI(反映MMP大小的指標)從(18.5± 2.2)%(正常對照組)降低至(4.8±0.9)%，2組差異非常顯著(P＜0.01)。然而，80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h可使MFI升高至(9.2±2.1)%，與HG處理組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。與柚皮苷對MMP保護作用相似，50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也能分別對抗HG對心肌細胞線粒體的損傷，使MFI分別增加至(8.7±1.7)%和(9.5±1.1)%(均P＜0.01)。單獨柚皮苷、LA或ObRa預(yù)處理本身對H9c2心肌細胞的MMP大小無顯著作用。

Figure 6.Both naringin(NRG)and the inhibitors of leptin pathway attenuated high glucose(HG)-induced decline in mitochondrial member potential(MMP)in H9c2 cardiac cells.LA:leptin antagonist;ObRa:leptin receptor antagonist.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖6 柚皮苷和瘦素通路抑制劑減輕高糖引起的心肌細胞線粒體膜電位下降

討論

高血糖被認為是糖尿病的一個重要特征，是導致糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素之一，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)。但是，迄今有關(guān)高糖引起心肌細胞損傷的病理生理機制尚未明了。本研究利用高糖損傷H9c2心肌細胞模型［12］再次證實，高糖對心肌細胞有明顯損傷作用，表現(xiàn)為使細胞存活率降低、凋亡細胞增多、ROS生成增多及線粒體損傷(MMP丟失)，這與前文的報道［3，12］相一致。

值得注意的是，本研究證實，高糖能明顯促進心肌細胞瘦素的表達。瘦素最初主要被認為調(diào)節(jié)肥胖或體重。但是，近年有研究報道，瘦素參與心血管疾病的發(fā)生，如心肌細胞肥大［6］。Majumdar等［6］證實，高糖能增加新生大鼠心肌細胞表達瘦素和內(nèi)皮素1，支持本研究的結(jié)果。由于瘦素的功能通過激活瘦素受體實現(xiàn)，本研究進一步觀察高糖對H9c2心肌細胞瘦素受體表達的影響。研究結(jié)果表明，高糖在促進心肌細胞瘦素表達的同時，也能上調(diào)瘦素受體的表達，提示高糖能激活瘦素-瘦素受體通路。

為了證實瘦素-瘦素受體通路在高糖損傷心肌細胞中的作用，本研究觀察了LA和ObRa對高糖損傷心肌細胞作用的影響，結(jié)果表明，瘦素拮抗劑和瘦素受體抑制劑均能明顯抑制高糖引起的損傷，使細胞存活率升高，凋亡細胞數(shù)量和ROS生成減少，MMP回升，提示瘦素-瘦素受體通路的激活可能是高糖引起心肌細胞損傷的重要機制之一，這條通路的激活可能參與高糖引起的細胞毒性、凋亡、氧化應(yīng)激及線粒體損傷等多種損傷作用。本研究為深入闡明高糖對心肌細胞的損傷機制提供了新穎的實驗依據(jù)。

柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物，除存在葡萄、葡萄柚等果實及果皮中外，還是中藥化橘紅、骨碎補等的主要有效成分，已被證實具有多方面的藥理學作用，如抗凋亡［3］、抗氧化［1-2］、降血脂［2］和降血糖［5］等。最近，我們證實，柚皮苷可通過抑制p38 MAPK通路對抗高糖引起的心肌細胞損傷作用［3，12］。本研究進一步證實柚皮柑也能明顯抑制高糖對心肌細胞瘦素和瘦素受體表達的上調(diào)作用，這為闡明柚皮苷抗高糖引起的心肌細胞損傷的機制提供了新的實驗材料，也為應(yīng)用食療法或中藥防治糖尿病引起的心血管損傷提供了新思路。由于p38 MAPK通路已被證實參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展［13-15］，在多種細胞實驗?zāi)Ｐ?，瘦素可激活p38 MAPK通路［16］，因此，深入探討瘦素-p38 MAPK通路在高糖損傷心肌細胞中的作用及柚皮苷的心肌保護作用有待今后進一步研究。

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Naringin protects against high glucose-induced injury by inhibiting leptin pathway in H9c2 cardiac cells

LIU Fu-zhen1，CHEN Jing-fu2，PAN De-mao3，TIAN Li-hong2，GUO Run-min2，YOU Qiong2，WU Keng2
(1Department of Endocrinology，2Department of Cardiology，Affiliated Hospital，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China;3Department of Internal Medicine，Region of Huangpu，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510700，China.E-mail:wukeng1245@hotmail.com)

AIM:To study whether naringin protects H9c2 cardiac cells against high glucose(HG)-induced injury by inhibiting the leptin pathway.METHODS:The expression levels of leptin and leptin receptor(LEPR)were detected by Western blotting.The cell viability was analyzed by CCK-8 assay.The changes of the morphology and the number of apoptotic cells were tested by Hoechst 33258 nuclear staining.The intracellular levels of reactive oxygen species(ROS) were measured by DCFH-DA staining.Mitochondrial membrane potential(MMP)was determined by rhodamine 123 staining.RESULTS:Treatment of the cells with 35 mmol/L glucose(HG)for 6～24 h up-regulated the expression of leptin in H9c2 cardiac cells with the peak value at 9 h.Treatment of the cells with HG for 1～24 h also enhanced the expression of LEPR，peaking at 12 h.Pretreatment with 80 μmol/L naringin for 2 h before exposure of the H9c2 cardiac cells to HG significantly inhibited the up-regulation of both leptin and LEPR induced by HG.Pretreatment of the cells with naringin for 2 h，leptin antagonist for 24 h，or leptin receptor antagonist for 2 h attenuated HG-induced injury in the cardiomyocytes，evidenced by an increase in cell viability，decreases in the number of apoptotic cells and intracellular ROS production as well as a recovery of MMP.CONCLUSION:Naringin may protect the cardiomyocytes against the HG-induced injury by inhibition of the leptin pathway.

Naringin;Leptin;Receptors，leptin;Hyperglycemia;Cardiomyocytes

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.008

1000-4718(2014)03-0423-07

2013-12-12

2014-01-28

湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目(No.湛科［2011］79號);廣東省重大科技專項(No.2012A080202020)

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