DC－CIK細(xì)胞免疫療法對卵巢癌患者免疫功能的影響及臨床意義

李新迪，孟凡旭，王 欣，劉 念，劉林林

DC－CIK細(xì)胞免疫療法對卵巢癌患者免疫功能的影響及臨床意義

李新迪，孟凡旭，王 欣，劉 念，劉林林＊

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林長春130041）

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，在我國，卵巢癌的死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重影響著女性的生命健康及生活質(zhì)量，因而一直受到人們的關(guān)注。卵巢癌的治療原則為手術(shù)、鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療及放療，但卵巢癌患者術(shù)后放化療療效并不十分明顯，且容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cell，CIK）過繼性免疫治療惡性腫瘤是一種新興的免疫治療手段，能有效抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞且無明顯不良反應(yīng)，降低腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的自身免疫力及生活質(zhì)量，而且其安全性得到了廣泛認(rèn)可［1－6］。近年隨著基礎(chǔ)科學(xué)研究的不斷進(jìn)展，卵巢癌過繼性細(xì)胞免疫治療研究成為熱點(diǎn)，它作為繼手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)療法之后的第四種治療手段，患者沒有明顯的毒副反應(yīng)，耐受性更好，生活質(zhì)量的改善明顯提高，在腫瘤的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。本研究通過檢測卵巢癌患者DC－CIK細(xì)胞免疫治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化及相關(guān)細(xì)胞因子變化，觀察DC－CIK細(xì)胞回輸對卵巢癌患者免疫功能的影響，為進(jìn)一步闡明機(jī)制及優(yōu)化臨床應(yīng)用進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1．1 研究對象 入選標(biāo)準(zhǔn)及對象：收集2009年3月－2012年3月就診于吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院腫瘤生物治療中心單純行DC－CIK細(xì)胞免疫治療的卵巢癌患者22例，所有患者行DC－CIK細(xì)胞免疫治療時(shí)間至少為末次治療（手術(shù)、放療或化療）后8周，既往未接受過細(xì)胞免疫治療；患者KPS評分≥60分，預(yù)期生存＞3個(gè)月；同時(shí)排除其他系統(tǒng)和器官的惡性腫瘤、急慢性感染性疾病、自身免疫病及糖尿病等疾病，見表1。

表1 22例卵巢癌患者臨床資料［n（%）］

患者排除標(biāo)準(zhǔn)：心、肝、腎功能不全；并發(fā)其他惡性腫瘤；有精神或心理疾病不能配合治療及療效評估者。

1．2 主要儀器與試劑

血細(xì)胞分離機(jī)（德國Kabi Fresenius公司），F(xiàn)icoll－Hypaque（美國Gibco公司），F(xiàn)C500流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），抗人IL－2、INF－γ、TNF－αELISA試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀（美國Themro公司）。

1．3 DC－CIK細(xì)胞的制備，參照文獻(xiàn)［7］

1．4 治療方法

對入組患者詳細(xì)了解病史，22例患者中漿液性癌17例，黏液性癌5例。Ⅰ期4例，Ⅱ期5例、Ⅲ期8例、Ⅳ期5例，患者年齡（60－76）歲，中位年齡65歲。全部患者距末次治療（手術(shù)或放、化療）均超過8周，KPS評分≥60分，預(yù)期生存＞3個(gè)月。

入組患者每周期治療前7天采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，第8天開始行DCCIK細(xì)胞回輸（1×109CIK及1×107DC細(xì)胞用0．9%生理鹽水100ml制成懸液，靜脈輸注，1h內(nèi)輸完，交替輸注一次共7次）。所有患者均為4－6周行1次DC－CIK細(xì)胞免疫治療，每名患者共行7周期治療。輸注細(xì)胞過程中密切監(jiān)測患者生命體征，隨訪48h觀察患者的短期不良反應(yīng)。

1．5 樣品采集

分別于第1周期單個(gè)核細(xì)胞采集當(dāng)天、第3、第7周期治療結(jié)束后第7天采集患者外周血，分別用CD3、CD4、CD8、CD56進(jìn)行熒光標(biāo)記，進(jìn)行T細(xì)胞亞群的檢測。

1．6 細(xì)胞因子測定

采用ELISA法檢測患者血清TNF－α、IL－2、INF－γ的表達(dá)水平，按試劑盒說明書操作。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)采用_x±s表示，各組樣本治療前后采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 治療前后患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化

在治療前和第3、第7療程結(jié)束后第7天分別抽取患者外周血，用美國Beckman Coulter公司FC500流式細(xì)胞儀，檢測患者外周血T細(xì)胞亞群：總T淋巴細(xì)胞（CD3＋）、T輔助細(xì)胞（CD3＋／CD4＋）、T抑制細(xì)胞（CD3＋／CD8＋）、免疫狀態(tài)（CD4＋／CD8＋）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）（CD3－／CD16＋56＋）、NKT細(xì)胞（CD3＋／CD16＋56＋）。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，治療后患者T淋巴細(xì)胞亞群有增高趨勢，其中輔助性T細(xì)胞亞群（CD3＋／CD4＋）、免疫功能（CD4＋／CD8＋）、NKT細(xì)胞亞群（CD3＋／CD16＋56＋）較治療前提高幅度較明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），見表2。

表2 患者外周血T細(xì)胞亞群表型變化（_x±s，%）

2．2 治療前后患者細(xì)胞因子表達(dá)水平變化

如表3所示，患者外周血細(xì)胞因子IL－2、TNF－α、IFN－γ經(jīng)3周期及7周期治療后復(fù)查均較治療前升高，其中7周期后復(fù)查有顯著差異（P＜0．05）。

表3 患者治療后CD4＋T細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞因子變化情況（_x±s，ng／L）

2．3 耐受性評估

患者經(jīng)DC－CIK細(xì)胞免疫治療后，食欲不振、疲倦乏力、失眠盜汗、情緒低落等方面明顯改善。

患者治療過程中，監(jiān)測內(nèi)容包括變態(tài)反應(yīng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟、胃腸道、全身癥狀等。結(jié)果顯示，在22例患者，共計(jì)154療程的治療過程中，5人次出現(xiàn)一過性發(fā)熱，體溫波動(dòng)在37－39℃之間，經(jīng)退熱對癥處理后緩解；2人次出現(xiàn)皮疹，經(jīng)脫敏對癥處理后消褪；3人次出現(xiàn)一過性心慌，但不排除輸注速度過快引起。1人次出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶的升高，經(jīng)對癥治療后降至正常；其他患者未出現(xiàn)發(fā)熱、肝、腎功能異常、心臟不適和皮疹等副反應(yīng)。見表4。

表4 DC－CIK細(xì)胞免疫治療后的不良反應(yīng)（n）

3 討論

腫瘤免疫主要依賴細(xì)胞免疫，機(jī)體依賴完整的免疫機(jī)制來有效地監(jiān)視和排斥癌變細(xì)胞，但癌變細(xì)胞因某些原因逃避免疫的監(jiān)視排斥而增殖到一定程度時(shí)，腫瘤的發(fā)生便不可避免。因而機(jī)體細(xì)胞免疫功能的低下往往是腫瘤難以治愈和容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因。腫瘤的免疫治療正是針對患者機(jī)體免疫力低下，針對性治療腫瘤的手段，是繼手術(shù)、化療、放療后腫瘤治療的第4種模式。而過繼性細(xì)胞免疫治療是腫瘤生物免疫治療中的重要手段，其宗旨在于通過提高機(jī)體的腫瘤抗原識別能力和免疫介導(dǎo)的腫瘤殺傷能力，從而打破患者的免疫耐受和免疫抑制狀態(tài)，起到延緩或減少腫瘤復(fù)發(fā)，提高腫瘤的治愈率和患者生存率的作用［8］。

DC和CIK是目前腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療中應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞。DC發(fā)現(xiàn)于1973年，是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞，能夠攝取并識別腫瘤相關(guān)抗原，再將抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞，有效誘導(dǎo)初始及靜息的T淋巴細(xì)胞增值和應(yīng)答［9］，在機(jī)體的免疫應(yīng)答以及抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。CIK是迄今發(fā)現(xiàn)的所有免疫效應(yīng)細(xì)胞中，增殖能力最強(qiáng)、細(xì)胞毒活性較強(qiáng)的細(xì)胞，其具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，同時(shí)還具有NK細(xì)胞非MHC限制性的抗腫瘤活性。DC、CIK二種細(xì)胞的聯(lián)合應(yīng)用，確保了一個(gè)高效的免疫反應(yīng)［10］，有效的殺傷腫瘤［11］。其主要機(jī)制目前認(rèn)為主要有以下3個(gè)方面［12－14］：①通過不同的機(jī)制識別腫瘤細(xì)胞后，釋放穿孔素、顆粒酶等毒性顆粒，直接裂解腫瘤細(xì)胞。②可以釋放大量具有抑（殺）瘤活性的細(xì)胞因子，如IFN－γ、IL－2、INF－α，從而直接抑制腫瘤細(xì)胞并通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)性對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。③CIK細(xì)胞還可以通過表達(dá)II型跨膜糖蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。CIK細(xì)胞免疫治療惡性腫瘤在國內(nèi)很多醫(yī)院已經(jīng)開展，以CIK細(xì)胞為基礎(chǔ)的過繼性免疫治療是近幾年腫瘤生物免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，并于胃腸道惡性腫瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌等多種惡性腫瘤病例中得到研究應(yīng)用，取得了顯著的療效。但眾所周知，抗腫瘤的細(xì)胞免疫是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，T細(xì)胞亞群數(shù)量及相應(yīng)細(xì)胞因子的變化的動(dòng)態(tài)觀測可為過繼療法的優(yōu)化應(yīng)用及機(jī)制探討提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究通過對卵巢癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的分析發(fā)現(xiàn)，DC－CIK細(xì)胞免疫治療后，患者外周血輔助性T細(xì)胞亞群（CD3＋／CD4＋）、免疫功能（CD4＋／CD8＋）、NKT細(xì)胞亞群（CD3＋／CD16＋56＋）與治療前相比，均有所升高，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），CD3＋／CD4＋、CD4＋／CD8＋、CD3＋／CD16＋56＋比值增加表明機(jī)體細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，提示DC－CIK細(xì)胞治療能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，患者免疫抑制狀態(tài)得到了最大程度地改善，進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞。

正常的生理情況下，Th1、Th2兩類輔助性Th細(xì)胞處于相互抑制、相互轉(zhuǎn)化的平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，機(jī)體就會處于Th1優(yōu)勢或Th2優(yōu)勢的漂移狀態(tài)，從而出現(xiàn)各種病理反應(yīng)。卵巢癌患者處于免疫抑制狀態(tài)，免疫功能越低，漂移越強(qiáng)［15］，在抗腫瘤免疫中，Th1類細(xì)胞因子應(yīng)具有更重要的作用，有報(bào)道稱［16］，腫瘤患者Th2較Th1相對存在優(yōu)勢，這可能與腫瘤免疫的抑制相關(guān)。Th1細(xì)胞主要分泌IL－2、IFN－γ、TNF－α和TNF－β。CIK可特異地聚集于腫瘤局部發(fā)揮靶向抗腫瘤作用；分泌大量的Th1類細(xì)胞因子［17］，有研究顯示，DC－CIK聯(lián)合治療可增加IFN－γ的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤作用。本研究結(jié)果提示，患者外周血IL－2、TNF－α、IFN－γ水平較治療前提高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），提示DC－CIK細(xì)胞免疫治療有助于患者機(jī)體Th1免疫增強(qiáng)，提高機(jī)體抗腫瘤能力。有研究顯示，DC的CD40可以和CIK細(xì)胞表面的CD40配體接觸并相互作用，從而促進(jìn)DC共刺激分子和特異性分子的表達(dá)，使DC分泌的細(xì)胞因子（如IL－2、IL－12、IFN－γ等）明顯增多，刺激CIK 細(xì)胞的增殖活性［18，19］，促進(jìn)CIK細(xì)胞成熟，而CIK細(xì)胞活化后可以產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子，如IL－2、IFN－γ、TNF－α等，進(jìn)一步抑制腫瘤、殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)值得注意的是，一些表面標(biāo)志物與患者預(yù)后密切相關(guān)，其可能同樣在免疫治療療效發(fā)揮中起到了關(guān)鍵作用，并有可能是未來過繼性免疫治療的發(fā)展方向［20，21］。

綜上所述，DC－CIK細(xì)胞治療能有效地提高卵巢癌患者的T淋巴細(xì)胞免疫能力并增強(qiáng)Th1類細(xì)胞因子抗腫瘤作用，有效提高患者生存質(zhì)量，且安全性良好。隨著細(xì)胞免疫學(xué)、分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，相信過繼性細(xì)胞免疫治療將在抗腫瘤治療中發(fā)揮更大的作用。

［1］Brenner MK，Heslop HE．Adoptive T cell therapy of cancer［J］．Curr Opin Immunol，2010，22（2）：251．

［2］Mesiano G，Todorovic M，Gammaitoni L，et al．Cytokine－induced killer（CIK）cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumors［J］．Expert Opin Biol Ther，2012，12（6）：673．

［3］Bernatchez C，Radvanyi LG，Hwu P．Advances in the treatment of metastatic melanoma：Adoptive T－cell therapy［J］．Semin Oncol，2012，39（2）：215．

［4］Cruz CR，Hanley PJ，Liu H，et al．Adverse events following infusion of T cells for adoptive immunotherapy：A 10year experience［J］．Cytotherapy，2010，12（6）：743．

［5］Di L，Zhu Y，Jia J，et al．Clinical safety of induced CTL infusion through recombinant adeno－associated virus－transfected dendritic cell vaccination in Chinese cancer patients［J］．Clin Transl Oncol，2012，14（9）：675．

［6］Montagna D，Turin I，Schiavo R，et al．Feasibility and safety of adoptive immunotherapy with ex vivo－generated autologous，cytotoxic T lympho－cytes in patients with solid tumor［J］．Cytotherapy，2012，14（1）：80．

［7］劉林林，劉 念，王 欣，等．DC聯(lián)合CIK細(xì)胞對中晚期消化系統(tǒng)腫瘤患者的免疫功能的影響［J］．中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)雜志，2010，14（9）：81．

［8］Thome SH，Negrin RS，Contag CH．Synergistic antitumor effects of immune cell viral biotherapy．Science，2006，311（5768）：1780－1784．

［9］Marten A，Ziske C，Schottker B，et al．Interactions between dentritic cells and cytokine－induced killer cells lead to an activation of both populations［J］．J Immunol，2001，24（6）：502．

［10］Topalian S L，Weiner G J，Pardoll D M．Cancer immunotheraphy comes of age［J］．J Clin Oncol，2011，29（36）：4828．

［11］Zitvogel L，Tesniere A，Kroemer G．Cancer despite immunosurveillance：immunoselection and immunosubversion［J］．Nat Rev Immunol，2006，6：715．

［12］Mehta BA，Schmidt－Wolf IG，Weissman IL，et al．Two pathwaysof exocytosis of cytoplasmic granule contents and target cell killing by cytokine－induced CD3＋CD56＋killer cells［J］．Blood，1995，86（9）：3493．

［13］Hoyle C，Bangs CD，Chang P，et al．Expansion of Philadelphia chromosome－negative CD3（＋）CD56（＋）cytotoxic cells from chronic myeloid leukemia patients：In vitro and in vivo efficacy in severe combined immunodeficiency disease mice［J］．Blood，1998，92（9）：3318．

［14］Verneris MR，Kornacker M，Mail?nder V，et al．Resistance of exvivo expanded CD3＋CD56＋T cells to Fas－mediated apoptosis［J］．Cancer Immunol Immunother，2000，49（6）：335．

［15］Yang P，Qiu G，Wang S et al．The mutations of Th1cell－specific T－box transcription factor may be associated with a predominant Th2phenotype in gastric cancers［J］．Int J Immunogenet，2010；37（2）：111．

［16］Ye YB，Peng F，Li JY，et al．Significance of the expression of lymphocytes and cytokines infiltrating in HCC［J］．Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2011，27（10）：1056．

［17］Franceschetti M，Pievani A，Borleri G et al．Cytokine－induced kil－ler cells are terminally differentiated activated CD8cytotoxic TEMRA lymphocytes［J］．Exp Hematol，2009，37：616．

［18］Chen HW，Liao CH，Ying C，et al．Ex vivo expansion of dendritic－cell－activated antigen－specific CD4＋T cells with anti－CD3／CD28，interleukin－7，and interleukin－15：Potential for adoptive T cell immunotherapy［J］．Clin Immunol，2006，119（1）：21．

［19］Marten A，Renoth S，von Lilienfeld－Total M，et al．Enhanced lytic activity of cytokine－induced killer cells against multiple myeloma cells after co－culture with idiotype－pulsed dentritic cells［J］．Haematologica，2001，86（10）：1029．

［20］Leffers N，Gooden MJ，de Jong RA，et al．Prognostic significance of tumor－infiltrating T－lymphocytes in primary and metastatic lesions of advanced stage ovarian cancer［J］．Cancer Immunol Immunother，2009，58（3）：449．

［21］de Jong RA，Leffers N，Boezen HM，et al．Presence of tumor－infiltrating lymphocytes is an independent prognostic factor in typeⅠandⅡendometrial cancer［J］．Gynecol Oncol，2009，114（1）：105．

李新迪（1987－），男，在讀碩士，主要從事腫瘤的基因和免疫治療研究。

2013－01－21）

1007－4287（2014）02－0283－04

＊通訊作者