沉默FRAT1基因對結腸癌HT－29細胞增殖與凋亡的影響及其機制研究

王蘇雅，于慶功＊，谷 偉，張欣欣，楊子榮，李文哲

沉默FRAT1基因對結腸癌HT－29細胞增殖與凋亡的影響及其機制研究

王蘇雅1，于慶功1＊，谷 偉1，張欣欣1，楊子榮1，李文哲2

（1．大連大學附屬中山醫(yī)院消化內科，遼寧大連116001；2．大連大學生命科學與技術學院免疫研究所，遼寧大連116622）

目的 探討沉默FRAT1基因對結腸癌HT－29細胞增殖、凋亡的影響及其可能分子機制。方法 將成功轉染FRAT1基因RNA干擾序列的人結腸癌HT－29細胞擴大培養(yǎng)，MTT比色法檢測細胞增殖，雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率，單染流式細胞術分析細胞周期，免疫熒光法激光共聚焦顯微鏡下觀察β－catenin蛋白變化。結果 轉染組細胞較對照組細胞生長明顯減緩（P＜0．01），凋亡率明顯增加（P＜0．01），細胞周期出現G0／G1期阻滯，差異顯著（P＜0．01），胞質β－catenin蛋白表達明顯下調。結論 FRAT1基因RNA干擾序列可以有效誘導結腸癌HT－29細胞凋亡和細胞周期阻滯，抑制細胞增殖，其機制可能通過下調β－catenin表達實現。

結腸癌；FRAT1；β－catenin；增殖；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0195）

FRAT1（frequently rearranged inadvanced T－cell lymphomas 1）基因為一種鼠原癌基因類似物［1］，研究發(fā)現在多種腫瘤中高表達［25］，其編碼蛋白是首個被發(fā)現的GSK（蛋白質糖原合成酶激酶）－3β抑制蛋白，通過抑制GSK－3β對β－catenin磷酸化發(fā)揮作用，因而是Wnt／β－catenin信號轉導通路的重要激活分子。β－catenin是Wnt／β－catenin通路核心成員，胞質內β－catenin異常蓄積可激活Wnt／βcatenin通路，促進細胞增殖抑制凋亡，最導致腫瘤發(fā)生［6－8］。本研究通過對FRAT1基因沉默的人結腸癌HT－29細胞進行檢測，來研究FRAT1對結腸癌細胞增殖、凋亡及細胞周期分布的影響及其可能機制，為FRAT1基因治療的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1．1 實驗材料 成功轉染FRAT1基因RNA干擾序列的人結腸癌HT－29細胞由本研究組前期實驗完成，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、PI、4＇，6－diamidino－2－phenylindole（DAPI）購自美國Sigma公司；Annexin V－FITC／PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司，兔抗人β－catenin單克隆抗體、FITC標記羊抗兔熒光二抗購自美國Santa Cruz公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 實驗分組 前期通過陽離子聚合物基因轉染方法，將有效干擾載體質粒、空載體質粒以及陰性對照質粒分別轉染人結腸癌HT－29細胞，并經過G418篩選，建立了穩(wěn)定轉染的細胞系，同時在HT－29細胞中單獨加入離子聚合物作為平行對照，四組依次命名為：HT－29－S、HT－29－neo、HT－29－NC以及HT－29。

1．2．2 MTT比色法繪制細胞生長曲線 取四組細胞分別調整細胞濃度至4×104／ml，將細胞懸液接種于96孔板。每孔加入200μl含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃環(huán)境的培養(yǎng)箱中。接種后于24h、48h、72h各收集細胞一次。各組細胞在收集后棄上清，加入含0．5%MTT的培養(yǎng)基200μl繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清后加入DMSO 150μl震蕩至結晶物充分溶解，用酶標儀測定490nm波長處各孔的吸光值（A值）。以時間為橫坐標，A值為縱坐標，根據各組吸光度繪制細胞生長曲線。

1．2．3 流式細胞術檢測細胞周期 將四組細胞以1×106／ml接種于25ml培養(yǎng)瓶，至80%融合時用胰酶輕微消化，冰PBS洗3遍，將單細胞懸液用一次性注射器針頭打入70%冰乙醇中，置4℃固定過夜。次日棄乙醇并用PBS洗2遍，加入含RnaseA的碘化丙啶（PI）染液，避光反應30min，使用流式細胞儀測定各組細胞周期。

1．2．4 Annexin V－FITC／PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率 取四組對數生長期細胞，收集培養(yǎng)基中懸浮死亡細胞，貼壁細胞用不含EDTA胰酶輕微消化后與之前收集的懸浮死亡細胞一起PBS洗2遍，濾網過濾并進行細胞計數以保證細胞密度在1－5×105／ml，加入500μl Binding Buffer懸浮細胞后加入5μl Annexin V－FITC和5μl PI，于室溫下避光反應15min，進行流式細胞儀檢測分析。

1．2．5 β－catenin免疫熒光染色 6孔板預置合適玻片，將四組細胞按4×105／ml密度分別接種于孔內玻片，在5%CO2，37℃環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞長滿玻片80%，取出PBS洗3遍，每次10min（以下PBS沖洗皆同此法），4%多聚甲醛固定20min，PBS沖洗，0．2%Triton－100在37℃通透打孔15 min，PBS沖洗，胎牛血清封片30min吸凈封片液，滴加β－catenin一抗（1∶100），置于濕盒4℃過夜。次日PBS沖洗，滴加FITC標記的熒光二抗室溫避光孵育2h，PBS沖洗后DAPI染核，甘油封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1．2．6 統(tǒng)計分析 應用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行數據分析。計量資料以_x±s表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本兩兩比較采用SNK－q檢驗，計數資料率的比較用χ2檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 MTT法檢測轉染各組細胞生長曲線FRAT1基因沉默對HT－29細胞的增殖有明顯抑制作用，并且抑制具有時間依賴性。HT－29－S組細胞生長速度（吸光度A值）明顯低于HT－29組、HT－29－neo組和HT－29－NC組（P＜0．01），HT－29組、HT－29－neo組、HT－29－NC組三組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）（表1，圖1）。

表1 沉默FRAT1基因對HT－29細胞增殖的影響（A490吸光度值）（_x±s，n＝3）

圖1 四組細胞的生長曲線

2．2 流式細胞術檢測細胞周期 結果顯示，與HT－29、HT－29－neo和HT－29－NC組細胞相比，HT－29－S組G0／G1期細胞明顯增加（P＜0．01），G2／M期細胞明顯減少（P＜0．01），S期無明顯改變，表明FRAT1基因沉默后HT－29細胞發(fā)生了G1期阻滯，并對細胞增殖能力產生了抑制作用。（表2，圖2）。

圖2 默FRAT1基因對HT－29細胞周期的影響

表2 染沉默FRAT1基因對HT－29細胞周期的影響（_x±s，n＝3）單位：%

2．3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 經Annexin VFITC／PI雙染流式上機檢測結果顯示，HT－29、HT－29－neo、HT－29－NC和HT－29－S的早期凋亡率分別為（0．37±0．06）%，（0．40±0．11）%，（0．45±0．09）%，（40．05±2．59）%，陽性轉染組HT－29－S凋亡率顯著高于其他3組（P＜0．01）（表3，圖3），轉染沉默FRAT1基因可明顯促進HT－29細胞凋亡。

表3 沉默FRAT1基因對HT－29細胞凋亡率的影響（_x±s，n＝3）單位：%

圖3 轉染沉默FRAT1基因對HT－29細胞凋亡率的影響

2．4 免疫熒光檢測β－catenin蛋白的表達 β－catenin蛋白在腫瘤細胞中主要表達于細胞質，同時可見表達于胞核，而在正常細胞中只少量表達于細胞膜。免疫熒光共聚焦顯微鏡下圖片顯示，HT－29、HT－29－neo和HT－29－NC細胞爬片可見胞質內強熒光，并表達于胞核。HT－29－S細胞爬片胞質內顯示微弱熒光，胞核幾乎不表達（圖4）。結果表明轉染干擾RNA序列的HT－29細胞內β－catenin表達下調，FRAT1基因可能通過上調β－catenin表達來抑制細胞凋亡并由此促進細胞增殖。FRAT1在包括食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、腦膠質瘤在內的多種人類惡性腫瘤中存在表達上調現象。Guo等［4］發(fā)現腦膠質瘤中FRAT1蛋白表達量低者預后明顯好于FRAT1蛋白表達量高者，Zhang等［5］研究表明非小細胞肺癌

圖4 β－catenin在HT－29細胞中的表達情況

3 討論

FRAT1是一種最初發(fā)現于進展期T細胞淋巴瘤中的原癌基因，具有原癌結合蛋白屬性，在人染色體10q24．1處編碼一種分子量29kD（1Da＝0．9921u）的GSK－3β結合蛋白。多項研究證實，FRAT1mRNA量與腫瘤TNM分期密切相關。FRAT1蛋白通過與GSK－3β結合激活Wnt信號轉導通路，屬于該通路的激活因子。研究證實多種腫瘤存在Wnt通路異?，F象，在Wnt經典通路中，數種通路組成蛋白皆與β－catenin相互作用，因此βcatenin無疑是Wnt經典信號轉導通路的核心成員。β－catenin是一條由多肽鏈組成的胞質內蛋白，Wnt信號缺失時，β－catenin在其他蛋白的輔助下形成復合物［6］然后迅速降解［7］而不至在細胞中累積。當激活Wnt信號時，GSK－3β活性被抑制，導致β－catenin磷酸化異常，細胞質內出現大量游離β－catenin，進而β－catenin在胞核內增加，與核內T細胞因子／淋巴增強結合因子（Tcelltranscriptional factor／Lymphoid enhancer factor，TCF／LEF）形成復合物，激活cmyc、Cox－2、cyclin D1等基因，使細胞周期發(fā)生改變或產生異常蛋白，隨之發(fā)生癌變。一些學者研究證實，β－catenin在食管鱗狀細胞癌、乳腺癌的胞質胞核中均有顯著表達上調現象［8，9］，更有深入研究表明，胃癌組織中β－catenin高表達可能與病理學分型有關［10］。而在結腸癌中，高達66－79%出現胞質和胞核β－catenin異常表達［11］，但β－catenin高表達是否與FRAT1基因有關尚未見報道。

本研究用siRNA靶向干擾結腸癌HT－29細胞FRAT1基因，探討其對HT－29細胞增殖、凋亡的影響。采用MTT法檢測FRAT1蛋白表達降低或缺失的HT－29細胞增殖活性的變化，與空載體組、陰性對照組以及平行對照組比較，經FRAT1基因沉默后的HT－29細胞增殖活性顯著下降，并利用流式細胞術檢測FRAT1基因沉默后其細胞周期的變化，結果顯示FRAT1基因沉默對細胞周期產生了顯著影響，有效沉默組的細胞較多地被阻滯于G0／G1期，而空載體組、陰性對照組以及平行對照組G2／M期比例較高，FRAT1的表達缺失使腫瘤細胞不能及時停留于G2／M期，削弱了細胞的自我修復，從而抑制HT－29細胞增殖。在Annexin V－FITC／PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率的試驗中：FRAT1基因沉默組的HT－29細胞早期凋亡率達（40．05±2．59）%，與其他3組細胞差異顯著。這些均提示了FRAT1對HT－29細胞凋亡的負向調節(jié)作用。進一步的激光共聚焦顯微鏡下免疫熒光技術顯示，FRAT1基因的沉默干擾了Wnt／β－catenin信號通路中重要分子β－catenin的細胞內表達。由此我們推測FRAT1對Wnt／β－catenin信號通路中βcatenin蛋白表達的上調作用可能激活了Wnt／βcatenin信號通路，從而抑制了細胞的凋亡誘導效應促進其增殖。

我們的實驗數據支持以下結論：采用RNA干擾技術沉默FRAT1基因能夠抑制結腸癌HT－29細胞增殖并促進其凋亡，其機制可能與下調β－catenin表達有關。這表明利用RNA干擾技術沉默FRAT1基因有望成為治療結腸癌的一種新途徑。但結腸癌作為一種多基因、多因素惡性疾病，以FRAT1作為靶基因治療的更多依據以及其安全有效性等問題還需要在體內試驗中證實。

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Effect of FRAT1 gene Silencing on proliferation and apoptosis of Colon cancer HT－29 cells and possible relevant mechanism

WANG Su－ya1，YU Qing－gong1，GU Wei1，et al．
（1．Department of Gastroenterology，Affiliated hospital of Dalian University，Dalian116001，China；2．ImmunologyI nstitute，Life Science and Biotechnology College of Dalian University，Dalian116622，China）

Objective To investigate the influence of FRAT1gene on the proliferation and apoptosis of human colon cancer cell line HT－29cells，and explore its underlying molecule mechanism．Methods Flow cytometry with Annexin V－FITC／PI double staining was employed to detect cell apoptosis，and the changes in the cell cycle and proliferation of the cells were examined with flow cytometry with PI staining and MTT colorimetric assay，respectively．β－catenin protein localization was detected by indirect immunofluorescence．Results FRAT1siRNA could restrain HT－29cell proliferation，increase G0／G1phase cell ratio，induce tumor cell apoptosis（P＜0．01）．The expression ofβ－catenin at the cytoplasm was down regulated and inhibit the translocation into nucleus，Conclusion FRAT1siRNA effectively inhibits the expression of HT－29cells，and suppresses cell growth and improves cell apoptosis by up regulating the expressions ofβcatenin．

Colon cancer；FRAT1；β－catenin；proliferation；apoptosis

R735．3＋5

A

于慶功，男，主任醫(yī)師，碩士，研究方向：消化道腫瘤及內鏡治療。

2013－02－08）

1007－4287（2014）02－0195－05

＊通訊作者