五子衍宗丸高效液相色譜指紋圖譜研究*

劉偉,周建良,陳碧蓮,祝明

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310004)

五子衍宗丸高效液相色譜指紋圖譜研究*

劉偉1,周建良2,陳碧蓮2,祝明2

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,杭州 310004)

目的 建立五子衍宗丸的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法使用Agilent Extend C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色譜柱,柱溫30℃,以乙腈-甲醇(10∶1)和0.4%磷酸為流動(dòng)相,梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,并利用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)對(duì)主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果根據(jù)LC-MS數(shù)據(jù)、對(duì)照品比對(duì)或文獻(xiàn)參照對(duì)10個(gè)共有峰中的9個(gè)色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。用建立的對(duì)照指紋圖譜測(cè)定16批五子衍宗丸,其相似度均＞0.93。結(jié)論該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。該方法為五子衍宗丸的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

五子衍宗丸;指紋圖譜;色譜法,高效液相

指紋圖譜是評(píng)價(jià)含多組分的復(fù)雜中藥樣品整體質(zhì)量的有效手段,中藥或中成藥的色譜指紋圖譜分析方法是藥物指紋圖譜分析的一個(gè)分支[1-4]。近年來(lái),應(yīng)用色譜指紋圖譜分析方法對(duì)中藥材及中藥成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)已日益廣泛[5-7]。五子衍宗丸是由枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和車(chē)前子(鹽炒)加工制成的丸劑,具有補(bǔ)腎益精的功效[8]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010年版一部收載的五子衍宗丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定枸杞子、五味子甲素的薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)化學(xué)鑒別方法,但無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的五子衍宗丸含量測(cè)定主要是針對(duì)五味子甲素、五味子乙素[9-10]及金絲桃苷[11]等單一成分的高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法,這些方法遠(yuǎn)不能滿足中藥現(xiàn)代化的質(zhì)量控制要求。因此,為了更有效地控制五子衍宗丸的質(zhì)量,筆者采用HPLC法建立五子衍宗丸的指紋圖譜,以便實(shí)現(xiàn)從多藥物、多成分的系統(tǒng)化角度控制其內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-20ADXR高效液相色譜儀(配備在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和PDA檢測(cè)器);美國(guó)Agilent 6430液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有ESI離子源和美國(guó)Agilent 1260快速液相色譜儀(RRLC)(配有在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和可變波長(zhǎng)檢測(cè)器);KODO JAC 4020P超聲波清洗器;METTLERTOLEDO AG285電子天平(十萬(wàn)分之一)。

1.2 試藥 綠原酸(批號(hào):110753-200413)、金絲桃苷(批號(hào):1521-200202)、毛蕊花糖苷(批號(hào):111530-200505)、山奈酚(批號(hào):110861-200405)、五味子醇甲(批號(hào):110857-200406)、五味子甲素(批號(hào):0764-200107)和五味子乙素(批號(hào):110765-200407)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純(Merck),水為雙蒸水,磷酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),甲酸(純度＞98%,Merck)。共收集到7個(gè)廠家生產(chǎn)的16批五子衍宗丸,見(jiàn)表1。

表1 五子衍宗丸樣品來(lái)源Tab.1 Origin of wuzi yanzong pill sample

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫30℃;流動(dòng)相:A為乙腈-甲醇(10∶1);B為0.4%磷酸水溶液,梯度洗脫:0～5 min為5%～15%A;～15 min為15%～19%A;～25 min為19%～21%A;～70min為21%～90%A;流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 參照物溶液的制備 分別精密稱(chēng)取綠原酸12.03 mg,金絲桃苷18.09 mg,毛蕊花糖苷10.56 mg,山奈酚16.34 mg,五味子醇甲17.38 mg,五味子甲素16.83 mg,五味子乙素7.22 mg,用70%甲醇配成濃度分別為240.6,361.8,211.2,326.8,695.2,841.5, 288.8 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液,并于4℃保存。分別吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用70%甲醇分別稀釋10,6,15,30,30,30,30倍得到混合對(duì)照品工作液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品2 g,研細(xì),精密稱(chēng)定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲處理60 min,取出,放冷,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.4 各單味藥材供試品溶液的制備 取各單味藥材粉末各約1 g,按照“2.3”項(xiàng)方法處理后,制取單味藥材的供試品溶液。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液(批號(hào):2035337),在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次,分別對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的變化情況進(jìn)行考察。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.2%,相對(duì)峰面積的RSD均＜4.6%,表明方法精密度較好。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次的五子衍宗丸樣品(批號(hào):2035337)6份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定,分別對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的變化情況進(jìn)行考察。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.1%,相對(duì)峰面積的RSD均＜2.9%,表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào): 2035337),分別在制備后0,2,4,8,12,24和36 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,分別對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的變化情況進(jìn)行考察。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.1%,相對(duì)峰面積的RSD均＜3.8%,表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的確定

2.6.1 指紋圖譜的建立 取16批五子衍宗丸,按“2.3”項(xiàng)的方法制備各供試品溶液,吸取各供試品溶液5 μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)定并記錄色譜圖,得到16批五子衍宗丸HPLC指紋圖譜,根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間,確定共有峰,并選取其中10個(gè)共有峰作為特征指紋峰,建立的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖1。

2.6.2 共有指紋峰的標(biāo)定 五子衍宗丸HPLC指紋圖譜中,共有指紋峰10個(gè),以7號(hào)峰(山奈酚)為參照峰(S峰),計(jì)算各色譜峰保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中S峰的保留時(shí)間和峰面積比值,得到的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表2,3。

圖1 五子衍宗丸HPLC圖Fig.1 HPLC fingerprint of wuzi yanzong pill

2.6.3 共有指紋峰的指認(rèn) 使用LC-MS技術(shù)對(duì)HPLC指紋圖譜10個(gè)共有峰中的9個(gè)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。LC-MS分析條件如下:色譜條件與“2.1”項(xiàng)一致,僅流動(dòng)相B改為0.1%甲酸;質(zhì)譜電噴霧離子源(ESI),載氣溫度:350℃;載氣流速:10 L·min-1;噴霧電壓(Nebulizer):238 kPa;毛細(xì)管電壓:4 000 V;正離子檢測(cè)模式;碰撞電壓(Fragmentor)135 V;一級(jí)全掃描質(zhì)量數(shù)范圍100～1 000。共有峰的鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6.4 制劑與藥材的相關(guān)性 取“2.3”項(xiàng)得到的五子衍宗丸HPLC指紋圖譜與“2.5”項(xiàng)得到的各單味藥的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較,對(duì)比各吸收峰的紫外吸收光譜和相對(duì)保留時(shí)間,確定10個(gè)共有峰主要來(lái)源于菟絲子、覆盆子、車(chē)前子、五味子等4味藥材,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[12-16],結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 16批五子衍宗丸指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks of sixteen batches of wuzi yanzong pill

表3 16批五子衍宗丸指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks of sixteen batches of wuzi yanzong pill

表4 五子衍宗丸指紋圖譜共有峰指認(rèn)Tab.4 Analysis result of common peaks of wuzi yanzong pills

2.7 16批五子衍宗丸指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 將16批五子衍宗丸指紋圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”,進(jìn)行色譜峰匹配,匹配結(jié)果見(jiàn)圖2。相似度計(jì)算結(jié)果表明:16批樣品與生成的對(duì)照譜之間的相似度依次為0.992,0.988, 0.974,0.990,0.969,0.986,0.984,0.976,0.982, 0.949,0.952,0.998,0.930,0.996,0.961,0.965。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用PAD檢測(cè)器在波長(zhǎng)200～360 nm范圍對(duì)五子衍宗丸供試液進(jìn)行紫外掃描檢測(cè),結(jié)果供試品在254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下檢出峰數(shù)較多、且響應(yīng)較高,包含的信息量大,故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)曾選用甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果表明采用這兩種流動(dòng)相,色譜峰達(dá)不到分離要求,選擇乙腈∶甲醇(10∶1)-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí),色譜峰分離度好,出峰明顯增多且峰形有較大改善,所以選擇乙腈∶甲醇(10∶1)-0.4%磷酸溶液作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

圖2 16批五子衍宗丸HPLC指紋圖譜共有模式圖Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of sisteen batches of wuzi yanzong pill

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 分別以乙醇、甲醇和70%甲醇為提取溶劑,并采用超聲和加熱回流兩種提取方式。結(jié)果表明,當(dāng)以70%甲醇提取時(shí),色譜圖出峰數(shù)和響應(yīng)較理想,超聲和加熱回流兩種提取方式得到的色譜圖無(wú)明顯區(qū)別。為操作簡(jiǎn)便,本實(shí)驗(yàn)選擇70%甲醇超聲60 min為最終提取方法。

3.4 耐用性考察 本實(shí)驗(yàn)比較0.3%,0.4%和0.5%磷酸溶液(水相)對(duì)樣品測(cè)定的影響,結(jié)果在各條件下各成分均能基線分離,表明不同濃度的磷酸溶液(水相)對(duì)本方法幾乎無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)選取3種不同品牌的色譜柱Angilent Extend C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm),Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),Ecosil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果均得到滿意的分離度,表明本法對(duì)C18柱品牌無(wú)特殊要求。本實(shí)驗(yàn)還比較了25,30,35℃的柱溫對(duì)樣品測(cè)定的影響,結(jié)果在各條件下各成分均能得到較好的分離度,表明不同的柱溫對(duì)本方法幾乎無(wú)影響。

本研究建立了五子衍宗丸HPLC指紋圖譜分析方法,共有峰中9個(gè)成分已經(jīng)明確,可以反映4種藥材的特性與質(zhì)量。該方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好。應(yīng)用該方法研究五子衍宗丸,可以反映成藥內(nèi)在質(zhì)量和制備工藝的整體差異性。通過(guò)對(duì)7個(gè)廠家16批五子衍宗丸的指紋圖譜研究,獲得特征性、專(zhuān)屬性和整體性的綜合信息,為五子衍宗丸的整體質(zhì)量控制提供方法參考。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.029

HPLC Fingerprint Analysis of Wuzi Yanzong Pills

LIU Wei1,ZHOU Jian-liang2,CHEN Bi-lian2,ZHU Ming2
(1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China;2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310004,China)

ObjectiveTo establish the high performance liquid chromatography(HPLC)fingerprint ofwuzi yanzongpills.MethodsHPLC was performed on Agilent Extend C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a gradient elution system using acetonitrile:methanol(10∶1)-0.4%phosphoric acid as the mobile phase.The column temperature was set at 30℃and the flow rate was 1.0 mL·min-1.The eluate was detected at the wavelength of 254 nm.Chromatographic peaks were identified by LC-MS method.ResultsNine common peaks inwuzi yanzongpill samples were identified by comparing their LC-MS data with those of reference compounds and related reference reports.The HPLC fingerprint ofwuzi yanzongpills was finally developed based on the analysis of sixteen batches of samples and their similarities were above 0.93.ConclusionThis method has high precision,stability and repeatability.This study could be used for overall quality assessment ofwuzi yanzongpills.

Wuzi yanzongpills;Fingerprint;Chromatography,high performance liquid

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1360-05

2013-09-17

2014-01-29

*國(guó)家科技部“十二五”資助項(xiàng)目中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和信息化體系建設(shè)平臺(tái)(2012ZX09304-005)

劉偉(1989-),女,山東濟(jì)南人,碩士,研究方向:中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及新藥開(kāi)發(fā)研究。電話:(0)18042323810,E-mail:liuw1989@yeah.net。

祝明(1958-),女,浙江金華人,主任中藥師,碩士生導(dǎo)師,學(xué)士,研究方向:中藥有效成分及質(zhì)量控制研究。電話:0571-86734991,E-mail:zhumingd@hotmail.com。