瑞香狼毒葉提取物對皮膚石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

田仁君

(四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,綿陽 621000)

瑞香狼毒葉提取物對皮膚石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

田仁君

(四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,綿陽 621000)

目的 研究瑞香狼毒葉提取物對常見皮膚表面菌的抑菌活性。方法采用藥敏紙片法和二倍稀釋法測定瑞香狼毒葉提取物對石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結(jié)果瑞香狼毒葉95%乙醇提取物濃度為100 mg·mL-1時對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑達12.8 mm,對石膏樣毛癬菌抑菌圈直徑達12.0 mm,二氯甲烷萃取物對金黃色葡萄球菌最低抑制濃度(MIC)為0.25mg·mL-1,對石膏樣毛癬菌MIC為0.50mg·mL-1。結(jié)論瑞香狼毒葉提取物對石膏樣毛癬菌和金黃色葡萄球菌均有抑制活性,其中對金黃色葡萄球菌抑制活性較強。

瑞香狼毒葉提取物;抑菌活性;最低抑菌濃度

狼毒是一種不常用的中藥,其味苦辛、性平、有毒,瑞香狼毒是狼毒的正名,為瑞香科狼毒屬植物瑞香狼毒的干燥根,又名斷腸草[1]。歷代本草中狼毒是以瑞香科植物瑞香狼毒根收載入藥,具有清熱解毒、消腫、瀉炎癥、止?jié)?、祛腐生肌功能[2-3]。瑞香狼毒根提取物可以治療實體瘤、肺結(jié)核和牛皮癬,據(jù)最新報道還有抗病毒的作用,尤其是抗人免疫缺陷病毒的作用[4-7]。而瑞香狼毒地上部分莖和葉的化學(xué)成分以及生物活性還少見研究。人體皮膚表面菌主要由金黃色葡萄球菌和真菌石膏樣毛癬菌為代表,筆者以上述兩種人體皮膚表面菌為研究對象,對瑞香狼毒葉提取物進行抑菌活性研究,發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒葉可抑制人皮膚表面菌,報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥材 瑞香狼毒葉采自四川甘孜州的天然草場,將采回的瑞香狼毒葉陰干、粉碎備用(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院侯太平教授鑒定為正品瑞香狼毒);金黃色葡萄球菌、石膏樣毛癬菌(均由四川成都檢驗檢疫局提供標(biāo)準(zhǔn)菌株)。將菌株沾取微量的菌苔接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng),將培養(yǎng)好的典型單菌落轉(zhuǎn)種于滅菌的冷卻液體培養(yǎng)基中,利用搖床37℃培養(yǎng)成原液。用滅菌水把原菌液稀釋成濃度10-1、10-2、10-3……。每個濃度取2mL與培養(yǎng)基30mL混勻倒3個平板,27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),選生長菌落數(shù)在30～300個稀釋濃度作為實驗菌液,金黃色葡萄球菌實驗菌液為10-7,石膏樣毛癬菌實驗菌液為10-4。

1.2 儀器 RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠制造);W201B恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司);SHB-3循環(huán)水多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);802型超凈工作臺(天津醫(yī)療凈化設(shè)備廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);手提式壓力蒸汽消毒器(成都勝利醫(yī)用設(shè)備廠);游標(biāo)卡尺(上海精美量具廠);生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠);Ws70-1型紅外線快速干燥器(上海銀屏儀器儀表有限公司)。

1.3 瑞香狼毒樣品提取 稱取適量瑞香狼毒葉粉,用95%乙醇、無水乙醇回流提取,每種溶劑提取3次,合并3次提取液,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮至膏狀物,得到95%乙醇提取物和無水乙醇提取物[8-9]。將上述抑菌活性高的95%乙醇提取物,利用石油醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇進行依次萃取。萃取在分液漏斗中進行,萃取溶劑用量按照少量多次進行。每次萃取完畢將萃取液分離出來,再將剩下的進行第二次萃取,以此類推,將多次萃取液合并濃縮至膏狀物。分別得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、丙酮提取物、甲醇提取物[9-10]。

1.4 乙醇粗提物的抑菌活性(藥敏紙片法) 將溶解均勻的提取物用純化水稀釋為100,40,16, 6.4 mg·m L-14個濃度,以不加藥而加入樣品溶解劑的培養(yǎng)液作為空白對照。將濃度為10-7金黃色葡萄球菌菌液接種在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上,濃度為10-4石膏樣毛癬菌菌液接種在沙氏平板上。將滅菌冷卻好的直徑為6 mm圓紙片在稀釋好的提取樣品中浸泡透后取出,酒精燈上微烘后,依次貼于平板的位置3個,同時貼上空白對照。將貼好紙片的培養(yǎng)皿輕放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細菌培養(yǎng)24 h,真菌27℃培養(yǎng)5 d,然后利用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑[11-12]。每個樣品濃度平行做3次取平均值。

1.5 萃取物的抑菌活性 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)的測定:將滅菌好的裝有培養(yǎng)液試管排列在試管架上,第一管的裝量6 mL、其余都為3 mL[12-13]。加入藥液并稀釋:于第一支試管加入原藥液1 g,混勻后吸取3.0 mL加入第二管中,同法依次稀釋試管,最后一管棄去3.0 mL,使之成為遞減系列濃度。并同時設(shè)對照組。趁熱將試管放斜面,待培養(yǎng)液凝固后接入菌液0.1 mL,放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),金黃色葡萄球菌37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果,石膏樣毛癬菌27℃培養(yǎng)5 d后觀察結(jié)果。從無菌生長的各管中找出最低藥物濃度的試管,該管的藥物濃度,即MIC[7]。最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC)測定:待測定完MIC后,用接種環(huán)挑取無菌生長的試管上的培養(yǎng)物移種至不含樣品的斜面上,培養(yǎng)1～3 d后觀察有無菌落生長,未見菌落生長的試管所對應(yīng)的濃度即為最低殺菌濃度[7]。

1.6 二氯甲烷樣品對兩種菌處理后鏡檢 將樣品制成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)含藥平板,待平板在無菌室冷卻后取直徑為6 mm的石膏樣毛癬菌菌碟倒貼在藥平板上,同時設(shè)空白對照,27℃培養(yǎng)5 d后400倍顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含藥培養(yǎng)液,取10-7金黃色葡萄球菌菌液接種于含藥培養(yǎng)液中,同時設(shè)空白對照,37℃水浴振蕩培養(yǎng)24 h,取菌液0.01 mL滴加在平板上,37℃培養(yǎng)24 h,挑取平板上的菌落在400倍顯微鏡下觀察細菌形態(tài)變化[14]。

1.7 二氯甲烷樣品對真菌和細菌的生長曲線的影響[15]細菌:將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·mL-1(10倍MIC)的含藥培養(yǎng)液,接種金黃色葡萄球菌后在搖床上培養(yǎng),設(shè)不加藥為對照。分別于2,4,6,8,10,12, 14,16,18,20 h取菌液,稀釋為10-7,取10-7菌液0.01 mL滴加在平板上,培養(yǎng)計數(shù)。真菌:將樣品稀釋成濃度為2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含藥平板,設(shè)不加藥為對照。培養(yǎng)液平面上均勻放入新生長一致的三個石膏樣毛癬菌的菌餅(直徑6 mm),將菌餅帶菌絲的一面倒貼培養(yǎng)液表面,然后放入27℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),在第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10天定時測定平板上菌落的直徑增長,用十字交叉法測每個菌落的兩個直徑,以其平均值代表菌落的直徑[12-13,16]。

2 結(jié)果

2.1 乙醇粗提物的抑菌活性 結(jié)果見表1,2。從表1和表2可以看出瑞香狼毒葉95%乙醇提取物和無水乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和石膏樣毛癬菌都有抑菌作用,95%乙醇提取物抑菌效果明顯強于無水乙醇提取物,對金黃色葡萄球菌的抑菌效果略強于石膏樣毛癬菌。當(dāng)提取物濃度為100 mg·mL-1時,95%乙醇提取物抑菌圈高達12.8 mm。且隨著提取物濃度的增加兩種提取物抑菌效果也增加。所以選擇95%乙醇提取物作為下一步提取分離活性成分的起始物。

2.2 MIC和MBC 結(jié)果見表2。表3可以看出4種萃取物對2種皮膚菌都有不同程度的抑菌和殺菌效果,二氯甲烷萃取物抑菌和殺菌活性最高,其次是丙酮萃取物、甲醇萃取物,石油醚萃取物。二氯甲烷萃取物對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC值為0.25 mg·mL-1,對石膏樣毛癬菌MIC和MBC值高達0.5 mg·mL-1。所以實驗選擇二氯甲烷萃取物樣品作為抑菌機制研究的樣品。

表1 95%乙醇和無水乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和石膏樣毛癬菌的抑菌圈直徑Tab.1 Diameter of inhibition zone of Staphylococcus aureus and Trichophyton gypseum treated with 95%ethanol and anhychrous ethanol extract mm

表中數(shù)據(jù)為抑菌圈直徑,0.00表示沒有抑菌圈形成,濾紙片直徑為6.00 mm

Data in the table represent inhibition zone.“0.00”means no inhibition zone.The diameter of filter paper is6.00mm

2.3 鏡檢結(jié)果 結(jié)果見圖1,2。圖1A可以看出石膏樣毛癬菌對照組菌絲分支均勻,節(jié)與節(jié)之間連接緊密,而圖1B處理組的菌絲分支扭曲混亂,節(jié)與節(jié)之間間距大,許多還有脫節(jié)現(xiàn)象,頂端有異常分支及膨大。圖2A可以看出金黃色葡萄球菌對照組菌外表光滑,呈球型串珠狀,而圖2B處理組中菌體間完全粘連在一起呈麻繩狀,菌體扭曲變形呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,完全看不出是什么菌種。

2.4 生長曲線 結(jié)果見圖3,4。從圖3中可以看出樣品對金黃色葡萄球菌生長曲線影響非常明顯,CK曲線6 h前是延滯期,6～14 h是指數(shù)期,14～20 h是穩(wěn)定期,處理組沒有達到正常的生長高峰,8 h后就進入衰亡期,從曲線可以推斷藥物主要抑制菌的指數(shù)期。圖4中CK生長曲線顯示3～7 d石膏樣毛癬菌出現(xiàn)了快速生長,7 d以后緩慢生長處于穩(wěn)定期,而藥物處理后菌的生長速度明顯減慢,對菌的每個生長期都有不同程度的抑制。

3 討論

本文最初提取溶劑選擇乙醇,因為乙醇是一種廣譜性溶劑,溶解能力強,溶解范圍廣,同時在有機溶劑中它最便宜,毒性最低,安全性最高,所以選擇乙醇作為最先的提取溶劑。萃取溶劑選擇是參考有機溶劑的介電常數(shù),石油醚(1.8)、二氯甲烷(9.08)、丙酮(20.7)、甲醇(32.7),溶劑的極性跟介電常數(shù)成正比[16],因此選用極性差別大且覆蓋極性范圍廣的這4種溶劑作為萃取溶劑。

表2 4種萃取物對金黃色葡萄球菌和石膏毛癬菌的MIC、MBC Tab.2 MIC and MBC of four kinds of extracts on Staphylococcus aureus and Trichophyton gypseum mg·mL-1

A.真菌對照;B.真菌處理圖1 二氯甲烷樣品對真菌處理后鏡檢圖(×400)A.Fungus control;B.Fungus treatmentFig.1 Microscopic exam ination on fungus treated with DCM sample(×400)

A.細菌對照;B.細菌處理圖2 二氯甲烷樣品對細菌處理后鏡檢圖(×400)A.bacterial control;B.bacterial treatmentFig.2 Microscopic exam ination on bacterial treated with DCM sam p le(×400)

圖3 金黃色葡萄球菌生長曲線圖Fig.3 Grow th curve of Staphylococcus aureus

圖4 石膏樣毛癬菌生長曲線圖Fig.4 Grow th curve of Trichophyton gypseum

藥物處理后鏡檢發(fā)現(xiàn)真菌菌絲生長緩慢,生長明顯受到抑制,菌絲層稀薄,菌絲粗細不均勻并且扭曲變形,節(jié)與節(jié)之間有斷裂現(xiàn)象。對真菌生長曲線的觀察,主要影響指數(shù)生長期,因此可以推測藥物可能抑制真菌細胞分裂。具體抑制其中哪些物質(zhì)還有待進一步研究。鏡檢發(fā)現(xiàn)細菌外形粗糙,菌體間粘連扭曲成麻繩狀,細胞形態(tài)不規(guī)則,顯著變形。而干擾細胞壁合成的藥物常會引起細胞形態(tài)的顯著變形,故推測藥物可能阻止或干擾了細菌細胞壁的合成來達到抑菌效果。具體抑菌機制還需進一步研究證實。

實驗結(jié)果證明,瑞香狼毒葉中含有抑皮膚菌的高活性成分,這些成分的極性與二氯甲烷相近,至于是單體化合物還是混合物還有待進一步提取分離。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.010

Inhibition of Extract from Leaf of Stellera chamaijasme L on Dermatic Staphylococcus aureus and Trichophyton gypseum

TIAN Ren-jun
(Sichuan Traditional Chinese Medicine Junior College,Mianyang 621000,China)

ObjectiveTo study the antibiotic activities of leaf extract ofStellera chamaejasmeLon the skin.MethodsActivities of the leaf extract onTrichophyton gypseumandStaphylococcus aureuswas examined by antibiotic susceptibility paper disk method and tube double dilution method.ResultsWhen extracted by 95%ethanol,the extract fromStellera chamaejasmeL at 100 mg·mL-1formed an inhibition zone with the diameter of 12.8 mm forStaphylococcus aureusand 12.0 mm forTrichophyton gypseum.When extracted by dichloromethane,the minimum inhibitory concentration(MIC) of the extract fromStellera chamaejasmeLwas0.25mg·mL-1forStaphylococcusaureusand 0.50mg·mL-1forTrichophyton gypsem.ConclusionLeaf extract ofStellera chamaejasmeL has an antibacterial activity againstStaphylococcus aureusandTrichophyton gypseumand the antibacterial activity againstStaphylococcus aureusis stronger.

Extract of the leaf ofStellera chamaejasmeL;Antibiotic activity;Minimal inhibitory concentration

R285

A

1004-0781(2014)06-0729-04

2013-06-10

2013-09-06

田仁君(1978-),女,四川南充人,講師,碩士,主要研究方向;中藥化學(xué)。電話:(0)18030999773,E-mail:skytrjll@163.com。