玉郎傘查爾酮對異丙腎上腺素致小鼠心室重構的保護作用*

黃建春,劉聰慧,周歡歡,譚麗鳳,黃建靜,李典鵬,黃仁彬

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所、廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室,桂林 541006;2.廣西醫(yī)科大學藥學院,南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,南寧 530021)

玉郎傘查爾酮對異丙腎上腺素致小鼠心室重構的保護作用*

黃建春1,2,劉聰慧3,周歡歡3,譚麗鳳2,黃建靜2,李典鵬1,黃仁彬2

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所、廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室,桂林 541006;2.廣西醫(yī)科大學藥學院,南寧 530021;3.廣西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,南寧 530021)

目的 研究玉郎傘查爾酮對異丙腎上腺素(ISO)致小鼠心室重構的保護并探討其機制。方法50只小鼠隨機分為空白對照組,模型組,卡托普利組,玉郎傘查爾酮低、高劑量組,每組10只。除空白對照組外其他組采用連續(xù)7 d皮下注射ISO 1 mg·kg-1誘導小鼠心室重構模型?？ㄍ衅绽M灌胃給予卡托普利65 mg·kg-1,玉郎傘查爾酮低、高劑量組尾靜脈注射玉郎傘查爾酮2.5,5.0mg·kg-1,給藥10 d。實驗結束時計算小鼠心臟、雙腎、肺質量指數(shù),觀察心肌病理形態(tài)學改變,比色法測定血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,心肌組織羥脯氨酸(Hyp)含量。蘇木精-伊紅(HE)和Masson’s染色,分析系統(tǒng)測量心肌細胞橫截面積(CSA)、心肌間質膠原容積分數(shù)(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)的變化。結果與空白對照組比較,模型組小鼠心臟、雙腎、肺質量指數(shù)明顯升高,血清SOD活性下降,血清MDA含量升高。與模型組比較,玉郎傘查爾酮組的心臟、雙腎和肺質量指數(shù)明顯降低,MDA含量明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)、SOD活性明顯升高(P＜0.01)、心肌組織中Hyp含量明顯降低(P＜0.01)。心肌膠原含量半定量分析顯示,CVF和PVCA顯著降低(P＜0.01)。結論玉郎傘查爾酮對ISO誘導的小鼠心室重構具有保護作用,其機制可能與清除氧自由基,提高機體的抗氧化能力有關。

玉郎傘查爾酮;異丙腎上腺素;心室重構

心室重構是心臟對多種心血管疾病的代償性反應,特征表現(xiàn)為心肌細胞的肥大而非增殖以及心肌組織的纖維化等,盡管最初的代償性肥厚可能有益于臨床癥狀的改善,但是持久的重構最終會導致心力衰竭。導致心室重構的因素包括機械負荷增加和交感神經活性升高[1]。玉郎傘(又稱龍眼參)是廣西壯族的一種習用草藥,為蝶形花科疏葉崖豆Millettia pulchraKurz var.laxior(Dunn)Z.Wei的塊根,具有補氣、補血、提高免疫力、抗衰老和抗應激等功能。玉郎傘查爾酮是由本課題組從玉郎傘60%乙醇提取物中分離得到的黃酮單體[2],前期的研究表明其具有清除自由基、抗氧化、耐缺氧和抗凝血作用[3],對心肌細胞缺氧/復氧損傷具有明顯的保護作用[4-6],同時對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用[7-8],但其對于心室重構有無干預作用筆者尚未見報道。小劑量連續(xù)皮下注射異丙腎上腺素(isoprenaline,ISO)可以明顯誘導實驗動物發(fā)生心肌細胞肥大和心肌間質的纖維化[9],筆者在本研究擬觀察玉郎傘查爾酮對ISO致小鼠心室重構的保護作用及機制,以期為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠50只,SPF級,雌雄各半,體質量18～22 g,由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(桂)2009-0002。

1.2 藥材 玉郎傘,采自廣西靈山縣,經廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為蝶形花科植物疏葉崖豆Millettia pulchraKurz var.laxior(Dunn)Z.Wei的塊根。

1.3 試劑 ISO購自上海禾豐制藥有限公司,批號: 120307;卡托普利購自湖南湘雅制藥有限公司,批號: 1201112;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供,批號分別為20130729,20130715, 20130906。

1.4 模型制備、分組與給藥 將小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為空白對照組、模型組、玉郎傘查爾酮低劑量組、玉郎傘查爾酮高劑量組、卡托普利組。根據文獻[10-12]略加改進制備小鼠心肌肥厚模型,除空白對照組外,其他各組均給予ISO 1 mg·kg-1,sc,每天2次,間隔8 h,連續(xù)7 d?？瞻讓φ战M皮下注射等容量0.9%氯化鈉溶液。每日上午注射給藥后4 h,玉郎傘查爾酮低、高劑量組尾靜脈注射玉郎傘查爾酮2.5, 5 mg·kg-1,給藥容積為10 mL·kg-1?？ㄍ衅绽M灌胃卡托普利65 mg·kg-1,給藥容積為20 mL·kg-1,均每天1次,連續(xù)14 d。模型組和空白對照組灌胃給予等容量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 測量指標

1.5.1 心臟、雙腎、肺質量指數(shù)測定 小鼠末次給藥后禁食不禁水12 h,稱取體質量,摘眼球取血后脫頸椎處死小鼠,迅速開胸取心臟、雙腎、肺,0.9%氯化鈉溶液洗盡殘血,濾紙吸干后稱量心臟、雙腎及肺質量,并計算心臟、雙腎、肺質量指數(shù)。

1.5.2 病理學指標觀察 10%甲醛溶液固定心肌組織梯度酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋,心肌組織5μm連續(xù)切片,行蘇木精-伊紅(hemotoxylin-eosin,HE)和Masson’s染色,用形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)測量心肌細胞橫截面積(cross section area,CSA)、心肌間質膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction,CVF)和血管周圍膠原面積(perivascular circumferential collagen area,PVCA)的變化。CSA(%)=各組心肌細胞橫截面積/空白對照組心肌細胞橫截面積×100%;CVF(%)=膠原面積/心肌總面積×100%;PVCA(%)=心室內小動脈管腔周圍面積/動脈管腔面積×100%。

1.5.3 血清SOD活性及MDA含量測定 SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,嚴格按照試劑盒說明在波長550 nm處測定血清中SOD活性。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法,嚴格按照試劑盒說明在波長532 nm處測定血清中MDA含量。

1.5.4 心肌組織Hyp含量測定 Hyp含量測定采用二甲氨基苯甲醛法,嚴格按照試劑盒說明操作,在波長550 nm處測定心肌組織Hyp含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據均以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 玉郎傘查爾酮對ISO誘導的心室重構小鼠心臟、雙腎、肺質量指數(shù)的影響 小鼠連續(xù)皮下注射ISO7 d后,與空白對照組比較,模型組心臟、雙腎、肺質量指數(shù)明顯升高;給予低劑量、高劑量玉郎傘查爾酮和卡托普利后可明顯抑制心臟、雙腎、肺質量指數(shù)的增加,與模型組比較,均差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05),表明玉郎傘查爾酮可抑制ISO引起的心肌肥厚。見表1。

2.2 玉郎傘查爾酮對ISO誘導心室重構小鼠CSA、CVF、PVCA和心肌組織Hyp含量的影響 與空白對照組比較,模型組小鼠心肌細胞CSA明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與模型組比較,玉郎傘查爾酮高劑量、低劑量組和卡托普利組CSA有下降趨勢,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。Masson’s染色顯示心肌細胞呈紅色,膠原纖維呈藍綠色。心肌膠原含量半定量分析顯示,與模型組比較,玉郎傘查爾酮高劑量、低劑量組和卡托普利組CVF和PVCA有降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。模型組ISO連續(xù)皮下注射7 d后,小鼠心肌組織中Hyp含量與空白對照組比較明顯增加(P＜0.01)。高劑量、低劑量玉郎傘查爾酮和卡托普利治療后能明顯抑制心肌組織中Hyp含量的增加,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表2和圖1,2。

表1 5組小鼠心臟、雙腎、肺質量指數(shù)的檢測值Tab.1 Detection resu lts of weight index of heart,kidneys and lung in five groups of mice mg·g-1,±s

表1 5組小鼠心臟、雙腎、肺質量指數(shù)的檢測值Tab.1 Detection resu lts of weight index of heart,kidneys and lung in five groups of mice mg·g-1,±s

與空白對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05;與模型組比較,*3P＜0.01,*4P＜0.05Compared with blank control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05; Compared with model group,*3P＜0.01,*4P＜0.05

只心臟指數(shù)雙腎指數(shù)肺重量指數(shù)空白對照組組別小鼠/ 10 4.20±0.62 10.88±1.37 5.26±0.47模型組10 5.07±0.59*112.30±1.42*25.90±0.63*2卡托普利組10 3.03±0.79*311.02±0.61*45.30±0.55*4玉郎傘查爾酮高劑量組10 4.32±0.51*310.27±0.64*35.32±0.55*4低劑量組10 4.37±0.58*410.82±1.28*45.42±0.42*3

表2 5組小鼠CSA、CVF、PVCA和心肌組織Hyp含量的檢測值Tab.2 Detection results of CSA,CVF,PVCA and Hyp content of heart tissue in five groups of mice±s

表2 5組小鼠CSA、CVF、PVCA和心肌組織Hyp含量的檢測值Tab.2 Detection results of CSA,CVF,PVCA and Hyp content of heart tissue in five groups of mice±s

與空白對照組比較,*1P＜0.01;與模型組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with blank control group,*1P＜0.01;Compared withmodel group,*2P＜0.01,*3P＜0.05

?

A.心肌細胞長軸(HE,×100);B.心肌細胞的橫截面(HE,×400);1.空白對照組;2.模型組;3.玉郎傘查爾酮低劑量組;4.玉郎傘查爾酮高劑量組;5.卡托普利組圖1 5組小鼠CSA的病理圖A.long axis of myocardial cells(HE,×100);B.cross-section of myocardial cell(HE,×400);1.Blank control group;2.Model group;3. Low-dose MHBFC group;4.High-dose MHBFC group;5.Captopril group.Fig.1 Pathological figure on CSA of five grous of mice

A.心肌間質纖維化;B.心肌血管周圍纖維化;1.空白對照組;2.模型組;3.玉郎傘查爾酮低劑量組;4.玉郎傘查爾酮高劑量組; 5.卡托普利組圖2 5組小鼠CVF和PVCA的病理切片圖(M asson's×400)A.Myocardial interstitial fibrosis;B.Myocardial perivascular fibrosis;1.Blank control group;2.Modelgroup;3.Low-dose MHBFC group; 4.High-dose MHBFC group;5.Captopril group.Fig.2 Pathological figure on CVF and PVCA of five groups of mice

2.3 玉郎傘查爾酮對ISO誘導心室重構小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響 ISO連續(xù)皮下注射7 d后,小鼠血清中SOD活性與空白對照組相比明顯下降(P＜0.01),MDA含量明顯增加(P＜0.01)。玉郎傘查爾酮低劑量、高劑量組和卡托普利組治療后能明顯抑制小鼠血清中SOD活性的降低和MDA含量的升高,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),見表3。

表3 5組小鼠血清中SOD和MDA的含量Tab.3 Content of serum SOD and MDA in five groups of m、ice

3 討論

筆者在本實驗中采用ISO皮下注射法制備小鼠心室重構模型,這種模型在學術界已有廣泛應用、方法可靠[10-13]。心室重構的形態(tài)學改變主要涉及心肌細胞和細胞外基質的變化,心肌間質中基質膠原的增加,以及膠原類型、組分、相互連接的改變是“心室重構”的重要組成部分。持續(xù)給予ISO后,模型組心肌中清除氧自由基的SOD活性降低,而反映組織過氧化程度的MDA濃度升高,說明心肌肥大的病理過程中有氧化應激的參與。過量的氧自由基作用于細胞膜上的不飽和脂肪酸,使膜脂質產生過氧化反應,造成心肌的不可逆性壞死。Hyp占膠原中總氨基酸的13.4%,可以代表膠原的水平,心肌肥厚的發(fā)生過程中,心肌Hyp水平升高,心肌細胞表型變化,體積增大,心肌細胞內收縮蛋白的類型改變,心肌間質細胞增殖,纖維組織增生,產生大量的膠原和纖維素,使心肌結構紊亂[14]。

筆者在本實驗中發(fā)現(xiàn),與空白對照組比較,模型組小鼠心臟質量指數(shù),心肌細胞CSA及心肌間質CVF顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),說明心肌肥厚模型制備成功。與模型組比較,玉郎傘查爾酮高劑量、低劑量組和卡托普利組MDA含量明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)、SOD活性升高(P＜0.01)、抑制心肌組織中Hyp含量(P＜0.05)。心肌膠原含量半定量分析顯示,CVF和PVCA顯著降低(P＜0.01)。提示玉郎傘查爾酮對ISO誘導的小鼠心室重構具有一定的逆轉作用,其機制可能與清除氧自由基,提高機體的抗氧化能力,抑制脂質過氧化物產生,減輕脂質過氧化所致心肌細胞膜的損傷等有關,其他相關信號轉導機制正在進一步的深入探討中。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.003

Protective Effects of 17-Methoxyl-7-hydroxy-benzene-furabcgakcone on Isoproterenolinduced Ventricular Remodeling in Mice

HUANG Jian-chun1,2,LIU Cong-hui3,ZHOU Huan-huan3,TAN Li-feng2,HUANG Jian-jing2,LI Dianpeng1,HUANG Ren-bin2
(1.Guangχi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization, Guangχi Institute of Botany,Guangχi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences,Guilin 541006,China;2.Pharmaceutical School,Guangχi Medical University,Nanning 530021,China;3.The First Clinical College,GuangχiMedical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate the effects of 17-methoxyl-7-hydroxy-benzene-furabcgakcone(MHBFC)on isoproterenol-induced ventricular remodeling inm ice.MethodsIsoproterenol(ISO)was given subcutaneously(1 mg·kg-1, twice per day for 7 d)to induce ventricular remodeling in mice.Mice were divided into normal control group,model group, captopril group,MHBFC low and high-dose groups.65 mg·kg-1captopril was given by intragastric administration in captopril group,2.5,5.0 mg·kg-1MHBFC were given by intravenous injection in MHBFC low and high-dose groups.At the end of the 7th day,the hearts of the mice were weighted,and myocardial hypertrophy index was expressed as heart weight/body weight, double kidneys weight/body weight and lung weight/body weight(HW/BW,KW/BW and LW/BW).Colorimetric method was used to determ ine the content of hydroxyproline(Hyp)in heart,the activity of superoxide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)in serum.The histological changeswere observed by HE and Masson’s staining,the changes of cross section area(CSA),collagen volume fraction,(CVF)and perivascular circumferential collagen area(PVCA)were determined.ResultsCompared with themodel group,MHBFC potently inhibited cardiomyocyte hypertrophy,decreased the HW/BW, KW/BW and LW/BW,improved cardiac pathology changed,increased the of activity SOD,decreased the content of MDA in serum and the content of Hyp in heart tissue(P＜0.01 orP＜0.05),decreased the CVF and PVCA(P＜0.01).ConclusionMHBFC possesses protective effects against ISO-induced ventricular remodeling inmice,whichmay be related to its actions in reducing the oxidative stress and improving the antioxidant activity of the body.

17-methoxyl-7-hydroxy-benzene-furanchalcone;Isoproterenol;Ventricular remodeling

R285.5

A

1004-0781(2014)06-0703-05

2013-10-23

2013-12-27

*廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室開放基金資助(FPRU2013-3);廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019175);2012年優(yōu)秀博士學位論文培育項目(YCBZ2012013)

黃建春(1980-),女,廣西貴港人,講師,博士,研究方向:抗肝炎藥物,心腦血管藥理學研究。電話:0771-5329140,E-mail:huangjianchun008@163.com。

李典鵬(1968-),男,廣西桂林人,研究員,博士,研究方向:植物活性物開發(fā)與利用。電話:0773-3550103, E-mail:ldp@gxib.cn。

黃仁彬(1955-),男,廣西靈山人,教授,博士生導師,博士,研究方向:抗肝炎、抗腫瘤藥物和心腦血管藥理學研究。電話: 0771-5339805,E-mail:huangrenbin518@163.com。