川芎嗪對咖啡因引起的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

王佳,高峰,張春兵

(江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京 210029)

·藥物研究·

川芎嗪對咖啡因引起的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

王佳,高峰,張春兵

(江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京 210029)

目的 分析川芎嗪對咖啡因引起大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,探討川芎嗪治療腦缺血-再灌注損傷的機(jī)制。方法制備咖啡因細(xì)胞損傷模型,通過CCK-8法活細(xì)胞檢測、流式細(xì)胞術(shù)線粒體膜電位測定、Western-blot檢測高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)觀察咖啡因的毒性及川芎嗪的保護(hù)作用。結(jié)果川芎嗪預(yù)處理后,PC12細(xì)胞的存活數(shù)顯著提高,細(xì)胞線粒體膜電位提高,HMGB1表達(dá)顯著降低,超氧化物歧化酶(SOD)上調(diào),乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)下調(diào),谷胱甘肽(GSH)升高。結(jié)論川芎嗪對咖啡因引起的PC12細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用,其保護(hù)作用可能與川芎嗪抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥性遞質(zhì)表達(dá)水平及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

川芎嗪;PC12細(xì)胞;損傷,腦缺血-再灌注

腦缺血-再灌注損傷是多種機(jī)制參與的一種復(fù)雜的病理生理過程,多種環(huán)節(jié)因素之間互相作用。抑制腦缺血-再灌注損傷是目前有效治療腦卒中的關(guān)鍵。鈣超載是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的“最后共同通路”[1-2]。細(xì)胞內(nèi)游離鈣的增加通常是細(xì)胞外鈣的內(nèi)流或細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放所致,咖啡因是興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常用的一種黃嘌呤制劑,作為細(xì)胞肌漿網(wǎng)里阿諾堿受體(ryanodine receptor)的激動(dòng)藥,能引發(fā)對ryanodine敏感的鈣庫釋放[3],常被用于制備神經(jīng)元鈣離子超載模型[4]。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)能減輕腦缺血-再灌注損傷程度,具有顯著的缺血后腦保護(hù)作用,前期研究以及其他實(shí)驗(yàn)報(bào)道,川芎嗪可以穿透血-腦脊液屏障,降低缺血-再灌注損傷區(qū)神經(jīng)元的凋亡[5-7]。大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12表達(dá)神經(jīng)生長因子受體,可誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)表型,廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究。筆者在本研究擬以PC12細(xì)胞為對象,制備咖啡因細(xì)胞損傷模型,觀察不同濃度川芎嗪對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用,探討川芎嗪降低咖啡因毒性的可能機(jī)制,進(jìn)而明確川芎嗪減輕腦缺血-再灌注損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試藥 鹽酸川芎嗪注射液(江蘇無錫市第七制藥廠,批號:012014,規(guī)格:2 mL∶40 mg);胎牛血清、馬血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle'smedium,DMEM)培養(yǎng)液(新西蘭Gibco公司,批號:1255136);咖啡因(美國Sigma公司,批號:C7050);明膠(美國Sigma公司,批號:G9382);CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司,批號:CK04-1000T);胰蛋白酶(美國Difco公司,進(jìn)口分裝);羅丹明(美國Invitrogen公司,批號:14521-80-3);mouse-anti-Rat HMGB1和mouse-anti-Rat actin(英國Abcam公司,批號:ab77302、ab6276);丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、硝酸纖維素膜(美國Amersham Bioscience公司);Enhanced Chemiluminescent試劑盒(美國Pierce公司,批號: 34095);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A001-1、A020-3、A003-1、A006-1、A061-2)。

1.2 細(xì)胞PC12細(xì)胞 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆株P(guān)C12細(xì)胞,購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 儀器 流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson);酶標(biāo)儀3350、洗板機(jī)1575、蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad);凝膠成像分析儀、圖像分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物作用

1.4.1 培養(yǎng)及傳代 PC12細(xì)胞疏松貼壁生長,完全培養(yǎng)液是含10%滅活胎牛血清和10%滅活馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,葡萄糖溶液濃度4.5 g·L-1, pH7.4。培養(yǎng)于含5%二氧化碳(CO2)的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。0.1%明膠預(yù)先包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶,備用。在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中70%單層后傳代,吸去舊培養(yǎng)液,加入新的培養(yǎng)液,用吸管吹下細(xì)胞,用移液器把細(xì)胞吹散,以1∶4的比例傳至新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,2 d后半量換液。

1.4.2 咖啡因模型建立 0.25%胰酶消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶單層細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔105個(gè),完全培養(yǎng)液100μL,隔天換培養(yǎng)液,生長至單層。加入5 mmol·L-1咖啡因,孵育24 h后,輕輕去除培養(yǎng)液;換上不含咖啡因的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng),每種濃度皆復(fù)孔培養(yǎng)[4]。

1.4.3 川芎嗪保護(hù)實(shí)驗(yàn) 0.9%氯化鈉溶液配置成川芎嗪0,0.1,1,10 mmol·L-14個(gè)濃度,預(yù)處理PC12細(xì)胞,孵育60 min后,輕輕去除培養(yǎng)液;洗滌后,換液,并加入5 mmol·L-1咖啡因,孵育24 h后,輕輕去除培養(yǎng)液;換上不含咖啡因的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng),每種濃度皆復(fù)孔培養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 CCK-8法檢測細(xì)胞毒性 培養(yǎng)結(jié)束后,每孔(包括空白孔)中加入CCK-8溶液10μL,37℃孵育2 h,酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度值(A值)。細(xì)胞活力(%)=(A加藥-A空白)/(A未加藥-A空白)×100%。A加藥指具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的A值,A空白指具有完全培養(yǎng)液和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的A值,A未加藥指具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的A值。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞線粒體膜電位 0.25%胰酶消化PC12細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液,接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100μL含細(xì)胞105個(gè),加入羅丹明123染液5μg·mL-1;細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)孵育15 min;完全培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次;重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中,細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)孵育60 min;流式細(xì)胞儀檢測:激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm。

1.5.3 Western-blot檢測高遷移率族蛋白B1(high mobility group box chromosomal protein 1,HMGB1)

1.5.3.1 提取細(xì)胞核蛋白及濃度測定 細(xì)胞核蛋白提取按照試劑盒說明書進(jìn)行,核蛋白濃度測定采用Bradford法,以0.5 mg·m L-1半血清清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.5.3.2 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gelel ectrophoresis,SDS-PAGE)和轉(zhuǎn)膜 核蛋白提取液變性后SDS-PAGE,以預(yù)染蛋白分子量Marker取得HMGB1的位置。濾紙、硝酸素纖維膜、凝膠等在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10 min后按順序安裝。恒壓100 V濕轉(zhuǎn)65 min。取出硝酸素纖維膜。5%脫脂奶粉溶液37℃封閉2 h。

1.5.3.3 雜交和顯影 抗HMGB1和抗β-actin分別以1∶2 000和1∶5 000稀釋于1%脫脂奶粉溶液中,4℃孵育過夜。0.5%PBST(磷酸鹽緩沖液1 000 mL+5 mL聚山梨酯20)洗膜5次,每次10 min。辣根過氧化物酶標(biāo)記goat-anti-mouse抗體以1∶5 000稀釋于1%脫脂奶粉溶液中,37℃孵育1 h。0.5%PBST洗膜5次,每次10 min。Pierce公司的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescent)A液1 mL,B液1 m L,混勻,漂洗硝酸素纖維膜。

1.5.3.4 圖像分析 將各測量組的電泳照片掃描至計(jì)算機(jī),然后應(yīng)用Bandscan分析軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度測定,并計(jì)算平均A值。

1.5.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA、LDH、GSH和GSSG)觀察 收集細(xì)胞,重懸,800×g離心10 min,棄去上清液,留沉淀,加入0.9%氯化鈉溶液150μL,在冰浴中手動(dòng)勻漿3 min,取勻漿液25μL測定。檢測方法按試劑盒方法進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用方差分析(analysis of variance,ANOVA)比較多個(gè)樣本之間的均數(shù),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪降低咖啡因神經(jīng)細(xì)胞毒性 咖啡因具有細(xì)胞毒性。應(yīng)用不同濃度的川芎嗪處理咖啡因(5 mmol·L-1)PC12細(xì)胞模型,川芎嗪呈劑量依賴性地提高細(xì)胞存活率,降低咖啡因神經(jīng)細(xì)胞毒性。見圖1。

2.2 川芎嗪拮抗咖啡因破壞線粒體膜電位 咖啡因模型組,可見熒光顯著增強(qiáng),表明線粒體膜電位下降;而經(jīng)過川芎嗪預(yù)處理后,熒光強(qiáng)度減弱,且亦可觀察到劑量依賴性,表明川芎嗪可以劑量依賴性地提高線粒體膜電位。見圖2。

與0 mmol·L-1川芎嗪組比較,*1P＜0.05圖1 不同濃度川芎嗪干預(yù)后的咖啡因處理細(xì)胞存活率Compared with 0 mmol·L-1TMP group,*1P＜0.05Fig.1 Survival rate of cells treated with caffeine after pretreatmentwith different concentration of TMP

紅線:0mmol·L-1川芎嗪+0μmol·L-1咖啡因;綠線: 0 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;藍(lán)線:0.1 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;黑線:1 mmol·L-1川芎嗪+ 5mmol·L-1咖啡因;紫線:10 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因圖2 川芎嗪對咖啡因降低線粒體膜電位的拮抗作用Red line:0 mmol·L-1TMP+0μmol·L-1caffeine;Green line:0 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Blue line: 0.1 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Black line: 1 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Purple line: 10mmol·L-1TMP+5mmol·L-1caffeineFig.2 Antagonism of TMP on the reduction of mitochondrialm embrane potential by caffeine

2.3 川芎嗪調(diào)控核蛋白HMGB1 在蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分別是29 000和45 000處有表達(dá)條帶,分別是HMGB1和β-actin蛋白表達(dá)。陰性對照組HMGB1表達(dá)為(2.6±0.6),5 mmol·L-1咖啡因模型組HMGB1表達(dá)為(123.1±9.2),與陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),1 mmol·L-1川芎嗪預(yù)處理后, HMGB1表達(dá)顯著降低,為(91.7±8.7),與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 川芎嗪調(diào)控咖啡因模型組氧化應(yīng)激反應(yīng) 咖啡因模型組SOD降低,LDH和MDA上升,GSH降低, GSH/GSSG降低;川芎嗪預(yù)處理組SOD上調(diào),LDH和MDA下調(diào),GSH升高,上調(diào)GSH/GSSG比值。見表1。

3 討論

腦缺血-再灌注損傷是多種機(jī)制參與的一種復(fù)雜病理生理過程,主要與自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等多種機(jī)制有關(guān),多種環(huán)節(jié)因素之間互相作用,進(jìn)一步促進(jìn)腦缺血-再灌注損傷后的神經(jīng)功能破壞、腦梗死灶形成。腦缺血-再灌注損傷后通常出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞死亡和遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡兩種形式,后者是一種細(xì)胞主動(dòng)性死亡,稱之為凋亡,是腦缺血-再灌注損傷的最重要形式。

線粒體跨膜電位的降低是細(xì)胞凋亡早期的不可逆事件,線粒體是多種促細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的靶點(diǎn),同時(shí)也是細(xì)胞死亡通路的整合元件,在各種促細(xì)胞凋亡信號作用下,線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔不可逆過度開放,導(dǎo)致線粒體跨膜電位崩解,呼吸鏈解耦聯(lián),線粒體基質(zhì)滲透壓升高,內(nèi)膜腫脹,釋放出膜間促凋亡蛋白,最終引起細(xì)胞凋亡。在多數(shù)條件下,線粒體內(nèi)鈣離子的過度聚積可使膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,引起線粒體功能障礙,啟動(dòng)神經(jīng)元的死亡和凋亡[8]。而咖啡因作為細(xì)胞肌漿網(wǎng)理阿諾堿受體的激動(dòng)藥,能引發(fā)鈣庫釋放[3],筆者觀察到咖啡因模型組,線粒體膜電位下降,而川芎嗪可抑制鈣的超載,提高線粒體膜電位,抑制細(xì)胞凋亡。

早期對HMGB1的研究主要是作為一種重要的晚期炎癥遞質(zhì)介導(dǎo)膿毒癥的病理過程,此作用依賴于IL-13介導(dǎo)的JAK/STAT信號通路。HMGB1還參與自身免疫性疾病(如關(guān)節(jié)炎等)、腫瘤、缺血-再灌注損傷等多種非感染性炎癥疾病的病理過程。此外,HMGB1具有抗凋亡作用,p53/HMGB1復(fù)合物可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[9]?？Х纫蛑?lián)p傷模型中,HMGB1高表達(dá),提示咖啡因致細(xì)胞受損過程中HMGB1主要起炎癥因子而非抗凋亡。有研究顯示在肝臟缺血-再灌注損傷可以檢測到HMGB1,并且阻斷HMGB1可以改善肝臟損害[10]。咖啡因致?lián)p傷模型中,觀察到川芎嗪下調(diào)HMGB1的表達(dá),提示川芎嗪的保護(hù)效應(yīng)與炎癥性遞質(zhì)相關(guān)。

表1 不同濃度川芎嗪對咖啡因模型組氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Tab.1 Effect of different concentration of TMP on oxidative stress of caffeine group±s

表1 不同濃度川芎嗪對咖啡因模型組氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Tab.1 Effect of different concentration of TMP on oxidative stress of caffeine group±s

0組:0mmol·L-1川芎嗪+0μmol·L-1咖啡因;1組:0 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;2組:0.1 mmol·L-1川芎嗪+ 5mmol·L-1咖啡因;3組:1 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;4組:10 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;與0組比較,*1P＜0.05;與1組比較,*2P＜0.05Group 0:0 mmol·L-1TMP+0μmol·L-1caffeine;Group 1:0 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Group 2:0.1 mmol·L-1TMP+ 5mmol·L-1caffeine;Group 3:1 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Group 4:10 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Compared with group 0,*1P＜0.05;Compared with group 1,*2P＜0.05

組別例數(shù)SOD/ (U·mg-1) LDH/ (U·g-1) MDA/ (pmol·L-1) GSH GSSG (mg·g-1) 0 10 142.3±5.2 90.1±2.1 1.76±0.41 58.2±2.1 4.9±0.7 1 10 93.5±4.7*1162.4±5.2*12.96±0.58*129.7±2.8*14.3±0.9*12 10 112.4±3.7*2142.7±4.2*22.72±0.47 35.7±4.3*23.8±0.4 3 10 128.5±3.1*2123.5±3.7*22.62±0.52*238.7±2.8*23.9±0.6 4 10 131.7±4.1*2114.3±5.7*22.35±0.71*243.1±1.9*24.1±0.2*2

在正常機(jī)體內(nèi),活細(xì)胞可以從不同來源持續(xù)產(chǎn)生自由基,如線粒體從電子傳遞鏈釋放自由基,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)劑氧化亞氮等形成活性的亞硝基自由基,氧化還原反應(yīng)中活化的金屬通過Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生自由基,當(dāng)種種原因?qū)е麦w內(nèi)過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、過氧自由基(O2-)等各種活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)超過機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化能力,則引起機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào),發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。多方面的神經(jīng)病理學(xué)研究顯示,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與供體的氧化產(chǎn)物水平增加有密切關(guān)系,因?yàn)槟X和神經(jīng)內(nèi)含有大量的脂質(zhì)、耗氧量較高,而神經(jīng)元不能分裂,所以ROS蓄積引起的損傷有可能是疾病發(fā)生發(fā)展的重要誘因[11]。氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化提示可能是咖啡因引起鈣離子超載,從而導(dǎo)致能量耗竭產(chǎn)生大量氧自由基。這些氧自由基引發(fā)了氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變,以至脂質(zhì)過氧化損傷。而川芎嗪可能通過某種途徑抑制鈣的超載,調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制脂質(zhì)過氧化損傷。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.001

Protective Effect of Tetramethylpyrazine on Caffeine-induced PC12 Cell Injury

WANG Jia,GAO Feng,ZHANG Chun-bing
(1.Department of Clinical Laboratory,Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo analyze whether tetramethylpyrazine could protect PC12 cells from injuries induced by caffeine,and to explore themechanism of tetramethyipyrazine in the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsCaffeine was added to induce apoptosis of PC12 cells.Cytotoxicity was detected by CCK-8 assay.The electric potential of mitochondrialmembrane was determined by flow cytometry.HMGB1 was detected by Western blotting.Oxidative stress was detected by ELISA.We observed toxicity of caffeine and the protective effects of tetramethylpyrazine.ResultsAfter the pretreatment,tetramethylpyrazine significantly improved PC12 cell survival.Mitochondrial membrane potential was increased,the expression of HMGB1 decreased,SOD increased,LDH and MDA decreased,and GSH elevated.ConclusionTetramethylpyrazine exerts a significant protective effect on PC12 cell injury caused by caffeine.The protective effectmay be related to inhibition of apoptosis and regulation of the expression level of mediators involved in inflammation and oxidative stress.

Tetramethylpyrazine;PC12 cells;Injury,cerebral ischemia-reperfusion

R965

A

1004-0781(2014)06-0695-04

2013-06-13

2013-08-24

*江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BE2010768);國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171659)

王佳(1980-),女,江蘇常州人,主管技師,碩士,研究方向:醫(yī)學(xué)免疫學(xué)。電話:025-86617141-90306,E-mail:gaof_1218@163.com。

張春兵(1969-),男,江蘇鹽城人,主任技師,博士,研究方向:醫(yī)學(xué)免疫學(xué)。電話:025-86617141-90306,E-mail:chbingzh@163.com。