利用赤星病菌毒素快速高通量鑒定煙草抗性種質(zhì)的方法研究

孫麗萍，時 焦，孟 坤，雒振寧，張峻銓，王鳳龍

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利用赤星病菌毒素快速高通量鑒定煙草抗性種質(zhì)的方法研究

孫麗萍1,2，時 焦1*，孟 坤1,2，雒振寧1,2，張峻銓3，王鳳龍1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司青島卷煙廠，青島 266101）

為尋求一種快速高通量篩選鑒定煙草抗赤星病種質(zhì)或材料的方法，本研究以煙草（L.）種質(zhì)凈葉黃、Beinhart1000-1、NC89和G140作為供試材料，利用煙草赤星病菌毒素就煙草種質(zhì)對赤星病的抗病性鑒定方法進(jìn)行研究，試驗設(shè)計3種鑒定方法：毒素液浸根法、毒素液浸種法和毒素培養(yǎng)基法。為驗證毒素培養(yǎng)基法鑒定結(jié)果的可靠性，對煙草種質(zhì)材料凈葉黃、Beinhart1000-1、NC89、G140、K326、G28和中煙100的室內(nèi)鑒定結(jié)果，與其對煙草赤星病的田間抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，室內(nèi)鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果之間極顯著相關(guān)（=-0.9588），室內(nèi)鑒定結(jié)果可準(zhǔn)確反映煙草種質(zhì)對赤星病的抗病性。

煙草；赤星??；真菌毒素；篩選方法

煙草赤星病是由鏈格孢菌[(Fries) Keissler]引起的為害相當(dāng)嚴(yán)重的葉斑真菌病害之一[1-2]。防治該病最經(jīng)濟(jì)有效的措施是選育和利用抗病種質(zhì)[3]。鑒定煙草種質(zhì)對赤星病抗性的常規(guī)方法有3種，一是毒素液浸根法[4]，二是離體葉片接種法（也稱懸滴接種法）[5]，三是田間鑒定。這些方法都是利用成苗或成熟煙株或葉片進(jìn)行鑒定。不僅需要時間長，而且占地面積大。因此，研究簡便快捷的煙草抗赤星病種質(zhì)鑒定方法十分必要。

植物病原真菌能夠產(chǎn)生真菌毒素[6]，包括寄主?；远舅兀℉ost Specific Toxins, HST）及非寄主?；远舅兀∟on-Host Specific Toxins, NHST）[7-8]。赤星病菌在寄主體內(nèi)和培養(yǎng)過程中均可產(chǎn)生毒素[9]。董漢松等[4]利用毒素液浸根法開展了赤星病菌毒素對煙草幼苗致病性的研究，發(fā)現(xiàn)煙草品種幼苗對毒素的抗性與懸滴接種法測定的相同品種對病原菌的抗病性一致，肯定了運(yùn)用毒素篩選煙草抗赤星病種質(zhì)的可靠性。Ishida等[10]將赤星病菌產(chǎn)生的毒素液加到培養(yǎng)基中，用于培養(yǎng)對煙草赤星病抗性不同的煙草種質(zhì)的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)細(xì)胞的死亡率比感病種質(zhì)的低很多。郭永峰[11]報道，運(yùn)用毒素對煙草種質(zhì)的成熟葉片進(jìn)行鑒定具有可靠性。Kodama等[12]研究表明，提純的毒素引起感病種質(zhì)、中抗種質(zhì)葉片壞死的濃度分別是1 μg/mL和20 μg/mL。以前科研工作者只是利用毒素對煙苗或者煙草成熟葉片的抗性水平進(jìn)行了初步的探索，尚無人利用毒素直接對煙草種子進(jìn)行鑒定的研究報道。為研制一種既快捷，又節(jié)省資源的新方法，我們開展了利用毒素直接對煙草種子進(jìn)行鑒定的方法研究。

1 材料與方法

1.1 供試煙草種質(zhì)

煙草種質(zhì)材料凈葉黃、Beinhart1000-1、NC89、G140、K326、G28和中煙100均由國家煙草中期庫提供。

1.2 菌株來源

煙草赤星病菌A1號菌株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗室提供。

1.3 毒素液的制備

參照董漢松等[4]介紹的方法并加以修改。首先從培養(yǎng)皿中繁殖的赤星病菌上取1個直徑5 mm的菌餅接種于120 mL查彼培養(yǎng)液中，在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4周，紗布過濾除菌絲體，再經(jīng)3～5次離心（8 000 r/min，10 min）、鏡檢無細(xì)胞，121 ℃濕熱滅菌15～30 min，得毒素液，用生物測定方法[13]確定毒素活性，然后貯藏備用。

1.4 鑒定方法研究

2011年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所開展試驗，設(shè)置了毒素液浸根法、毒素液浸種法和毒素培養(yǎng)基法3種鑒定方法，并對其進(jìn)行了研究。

1.4.1 毒素液浸根法 將毒素液用無菌水按不同倍比（原液、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64）稀釋，設(shè)相應(yīng)稀釋倍比的查彼培養(yǎng)液為對照，共14個處理。將2～3葉期煙草幼苗的根部洗凈，放入含有8 mL處理液的青霉素小瓶中，每瓶15～20株，重復(fù)4次。于25～28 ℃，14 h/d光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中應(yīng)及時補(bǔ)足蒸發(fā)的水分，96 h后觀察并測量根長。以查彼培養(yǎng)液浸種的煙苗根長為對照處理根長，計算毒素液對根長的抑制率[14]。

采用DPS軟件Duncan’s新復(fù)極差法（<0.05）對煙苗根長抑制率進(jìn)行差異顯著性分析。

1.4.2 毒素液浸種法 種子經(jīng)10%H2O2消毒后，放入滅菌的毒素液中浸泡，浸泡時間設(shè)4、8、16、24 h，同時設(shè)查彼培養(yǎng)液分別浸泡4、8、16、24 h的處理為對照，共8個處理。各處理按設(shè)計時間先浸于毒素或者查彼培養(yǎng)液中，后浸于水中，保證每個處理實(shí)際總浸種時間均為24 h。然后取20粒煙草種子置于含水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）內(nèi)，每皿為1個處理，重復(fù)4次。25～28 ℃，14 h/d光照條件下培養(yǎng)，第20天測量記錄根長，并以查彼培養(yǎng)液浸種的煙苗根長為對照處理根長，計算毒素液對根長的抑制率。采用DPS軟件Duncan’s新復(fù)極差法（<0.05）對煙苗根長抑制率進(jìn)行差異顯著性分析。

1.4.3 毒素培養(yǎng)基法 將同批次未消毒的毒素液與瓊脂或者水瓊脂混合，配制成不同稀釋倍比的含毒素固體培養(yǎng)基：原液（每升毒素液中加入瓊脂18 g）、1/2、1/4、1/8、1/16，121 ℃濕熱滅菌15～30 min。同時設(shè)相應(yīng)稀釋倍比的查彼固體培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基為對照，共11個處理，重復(fù)4次。其他操作同毒素液浸種法，以根系緊貼或伸入培養(yǎng)基中的程度以及葉片顏色為鑒定指標(biāo)，采用DPS軟件Duncan’s新復(fù)極差法（<0.05）對根系深入培養(yǎng)基中煙苗的比率進(jìn)行差異顯著性分析。

1.5 毒素培養(yǎng)基法可靠性的進(jìn)一步驗證

為進(jìn)一步驗證毒素培養(yǎng)基法的可靠性，就毒素培養(yǎng)基法對煙草種質(zhì)材料凈葉黃、Beinhart1000-1、NC89、G140、K326、G28和中煙100的室內(nèi)鑒定結(jié)果，與相應(yīng)煙草種質(zhì)材料對煙草赤星病的田間抗性鑒定結(jié)果（數(shù)據(jù)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所植保室2012年田間試驗調(diào)查結(jié)果）進(jìn)行相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)分析采用DPS統(tǒng)計軟件進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 鑒定方法研究

2.1.1 毒素液浸根法 從毒素對煙苗生長的抑制率來看（表1），不同稀釋倍比的毒素液對煙苗根系生長的影響不同。差異顯著性分析的結(jié)果（表1）顯示，毒素液濃度過高（原液）或者過低（1/64）時，其對4個種質(zhì)煙苗根系生長的影響差異不顯著；毒素液稀釋倍比為1/2、1/4時，抗病種質(zhì)和感病種質(zhì)之間的差異不能反映出種質(zhì)在田間的實(shí)際抗病性。這種現(xiàn)象的原因可能是在毒素選擇壓力很大時，抗病種質(zhì)不能克服毒素的抑制作用，在毒素選擇壓力過低時，感病種質(zhì)也能克服毒素的抑制作用。

毒素液稀釋倍比為1/8～1/32時，毒素對感病種質(zhì)NC89和G140根系生長的抑制作用顯著高于對抗病種質(zhì)Beinhart1000-1和凈葉黃的抑制作用（<0.05），見表1。因此，毒素稀釋倍比在1/8～1/32時，能夠鑒定不同煙草種質(zhì)對赤星病的抗感性。

2.1.2 毒素液浸種 抗感病種質(zhì)在毒素液中浸種后各處理幼苗根長抑制率之間差異顯著性分析結(jié)果顯示（表2），在4～24 h時，抗感病種質(zhì)幼苗根長抑制率之間差異不顯著，難以鑒定種質(zhì)抗感性差異。

表1 毒素液不同稀釋倍比對根長的抑制率

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（<0.05），表2、表3同。.

表2 抗感病種質(zhì)浸種處理的根長抑制率

2.1.3 毒素培養(yǎng)基法 對煙草抗感赤星病種質(zhì)幼苗根系深入毒素培養(yǎng)基中的比率進(jìn)行差異顯著性分析結(jié)果（表3）顯示，在5%的顯著水平下，抗病種質(zhì)凈葉黃幼苗根系在稀釋倍比為1/2的毒素培養(yǎng)基上深入基質(zhì)中的比率同其他3個種質(zhì)間差異不顯著，而在原液以及稀釋倍比為1/4～1/16的毒素培養(yǎng)基上時，均顯著高于同等條件下NC89和G140；從幼苗根系在不同稀釋倍比的含毒素培養(yǎng)基上的深入比率來看，Beinhart1000-1均高于NC89和G140。通過對比分析種質(zhì)間煙草幼苗根系在各個稀釋倍比含毒素培養(yǎng)基上緊貼或深入基質(zhì)中生長的比率，能夠鑒定出不同種質(zhì)對赤星病的抗感水平。

從葉片大小、顏色等外觀性狀來看（圖1），抗感病種質(zhì)煙株在培養(yǎng)基上生長情況的優(yōu)劣次序依次為：水瓊脂培養(yǎng)基、查彼培養(yǎng)基和毒素培養(yǎng)基。

2.2 進(jìn)一步驗證的相關(guān)分析結(jié)果

毒素培養(yǎng)基法鑒定的煙草幼苗根系深入基質(zhì)的比率同田間病情指數(shù)之間相關(guān)系數(shù)為=-0.9588，達(dá)極顯著水平（表4），進(jìn)一步說明了本方法的可靠性，能夠鑒定出不同品種對赤星病的抗性水平。

表3 抗感病種質(zhì)幼苗根系深入培養(yǎng)基中的比率

圖1 抗感病種質(zhì)在不同培養(yǎng)基上的生長情況

注：從上而下第1排為生長在查彼培養(yǎng)基上的凈葉黃幼苗；第2排為生長在查彼培養(yǎng)基上的NC89幼苗；第3排為生長在毒素培養(yǎng)基上的凈葉黃幼苗；第4排為生長在毒素培養(yǎng)基上的NC89幼苗。

表4 毒素培養(yǎng)基法鑒定煙苗根系深入基質(zhì)的比率與田間病情指數(shù)的相關(guān)性

注：“**”表示極顯著相關(guān)，＜0.01。

3 討 論

諸多學(xué)者運(yùn)用植物病原真菌毒素進(jìn)行植物抗感種質(zhì)的篩選鑒定研究，如無脅迫培養(yǎng)基法、脅迫培養(yǎng)基法[15-16]和雙層培養(yǎng)基法[17]，多建立在品系數(shù)量較少的基礎(chǔ)上。本文直接利用煙草種子作為鑒定材料，能夠在培養(yǎng)皿中于5周內(nèi)完成抗病性鑒定，為種質(zhì)材料的快速高通量鑒定提供了方法。對3種鑒定方法的研究結(jié)果顯示，毒素浸種法不能鑒定煙草種質(zhì)對赤星病的抗性水平。毒素浸根法能夠應(yīng)用于煙草種質(zhì)對赤星病的抗性水平鑒定，因抗感病種質(zhì)在一定稀釋倍比的毒素液中能夠表現(xiàn)出抗感差異，且與抗感病種質(zhì)在田間對赤星病的抗性表現(xiàn)相一致，這與董漢松等[4]的研究結(jié)果一致。但是在研究過程中我們發(fā)現(xiàn)此方法存在一定的弊端，首先試驗所用的瓶口不能封閉，易被雜菌所污染，從而影響煙草幼苗根系的生長；其次，這種方法需要一定的煙苗培育過程，比毒素培養(yǎng)基法耗時長1個多月。

毒素培養(yǎng)基法是依據(jù)在毒素影響下種子萌發(fā)后的生長過程，依據(jù)生長產(chǎn)生的差異進(jìn)行鑒定。在試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)查彼培養(yǎng)基能對煙草幼苗的生長產(chǎn)生一定的抑制作用，這與先前的研究報道一致[4]，煙草抗感赤星病種質(zhì)在一定稀釋倍比的毒素培養(yǎng)基上，抗性水平存在差異，與田間表現(xiàn)相一致，證明了其作為煙草抗赤星病種質(zhì)材料篩選方法的可行性，它作為一種新方法，具有以下特點(diǎn)：第一，直接利用種子鑒定，就可以在培養(yǎng)皿中完成煙草種質(zhì)對赤星病的抗性鑒定，比常規(guī)鑒定試驗省略了培養(yǎng)煙株的繁瑣，不僅節(jié)省了人力和物力，而且大幅縮短了鑒定時間。第二，使煙草對赤星病的抗性鑒定不受生長季節(jié)的限制，任何季節(jié)都能開展鑒定工作。第三，不受其他雜菌的干擾，亦不會產(chǎn)生類似懸滴接種法因接種用孢子分布不均而出現(xiàn)接種強(qiáng)度不一致的現(xiàn)象，從而造成鑒定誤差。

目前我國已啟動煙草基因組計劃，該方法的建立對于煙草突變體庫研究所獲得的大量突變體材料的快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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Investigation on the Method of Rapid Identifying Resistant Tobacco Germplasms toby Using its Mycotoxins

SUN Liping1,2, SHI Jiao1*, MENG Kun1,2, LUO Zhenning1,2, ZHANG Junquan3, WANG Fenglong1*

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Qingdao Cigarette Factory of China Tobacco Shandong Industrial Co., Ltd, Qingdao 266101, China)

In order to find out an approach to rapidly identify resistant tobacco germplasm to, tobacco varieties Jingyehuang, Beinhart1000-1, NC89 and G140 were used as test materials. Using toxins produced by brown spot fungus (), we carried out a comparative test to choose a better screening method. Three kinds of screening methods were designed: toxins liquid soaking root of tobacco, toxins liquid soaking seeds of tobacco, and toxin-containing medium screening method. To verify the reliability of the toxin-containing medium screening method, Correlation between laboratory test results and field data on tobacco varieties Jingyehuang, Beinhart1000-1, NC89, G140, K326, G28 and Zhongyan100 was analyzed, and correlation coefficient of -0.9588 was found, which suggests the effectiveness of laboratory method is close to those of field.

tobacco; brown spot disease; mycotoxin; identifying method

S572.08

1007-5119（2014）01-0080-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.015

中國煙草總公司科技重點(diǎn)項目（110201002022）

孫麗萍，女，碩士研究生，研究方向為植物病理學(xué)。E-mail：sunlpgod@163.com。

通信作者，E-mail：jshi42@sohu.com；wangfl64@gmail.com

2013-01-07

2013-03-27