離子液體作為流動相添加劑在高效液相色譜法分離黃柏堿和木蘭花堿中的作用機制*

楊勇，邊敏，李偉

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210046；2.南京工業(yè)大學理學院，南京 210009)

離子液體作為流動相添加劑在高效液相色譜法分離黃柏堿和木蘭花堿中的作用機制*

楊勇1，邊敏2，李偉2

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210046；2.南京工業(yè)大學理學院，南京 210009)

目的 建立黃柏堿與木蘭花堿的色譜分離方法,并通過考察各影響因素,探討離子液體在分離過程中的作用機制。方法以離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽為流動相添加劑,用高效液相色譜法分離黃柏堿和木蘭花堿,并分別考察流動相pH、離子強度、緩沖溶液種類、離子液體的種類、柱溫等影響因素,探討離子液體在整個分離過程中的作用機制。結果以20 mmol·L-1離子液體作為流動相添加劑等度洗脫即能達到兩種生物堿的基線分離。兩組分的保留值、分離度及理論板數(shù)隨著流動相條件的改變而不同。結論離子液體在黃柏堿與木蘭花堿的分離過程中以生成中性離子對的作用為主。

離子液體；黃柏堿；木蘭花堿；色譜法,高效液相；添加劑；流動相

黃柏堿與木蘭花堿是黃柏的主要活性成分,在黃柏藥材及相關劑型的鑒別及含量測定中,兩者常作為考察的主要指標,要求同時分離測定。用高效液相色譜法(HPLC)同時分離測定兩種生物堿的研究報道較少,且采用的方法以梯度洗脫為主［1-2］。這種方法分析周期短,峰型對稱,靈敏度好。但基線易漂移,重復性較差,對所用試劑的純度、黏度、色譜柱等實驗條件要求較高。因此在保證分離度、靈敏度的前提下,簡便易行的等度洗脫仍然是首選的分離測定方法。采用離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate,Bmim BF4)作為流動相添加劑可成功分離生物堿,減少試樣的拖尾峰,改善峰形,提高分離效率。與三乙胺(triethylamine, TEA)體系相比,生物堿的保留值降低幅度較小,在相同濃度下,分離效能較高［3］。此外,由于生物堿具有不同的結構及堿性,離子液體作為流動相添加劑在分離過程中的色譜行為不同,分離機制也有所不同。筆者以木蘭花堿、黃柏堿為分離研究對象,建立HPLC等度洗脫的分離測定方法,通過考察分離條件及影響因素,探討離子液體在此分離過程中的作用機制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu高效液相色譜系統(tǒng):LC-20AD泵, SPD-20A檢測器,7125進樣器,Class-VP色譜工作站。

1.2 試藥 標準品黃柏堿(批號:E-0638,純度> 99%)和木蘭花堿(批號:E-0306,純度>99%)均由上海同田生物技術有限公司提供；離子液體1-丁基-3-甲基咪唑鹵化鹽［BminX,X=氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)］, Bmim BF4,1-丁基-3-甲基瞇唑六氟磷酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate,Bmim PF6)根據(jù)文獻報道合成［4-5］,經莫爾法、分光光度法測定純度> 97%；乙腈(色譜純,天津康科德公司)；磷酸(優(yōu)級純,國藥集團化學試劑公司)；實驗用水為三蒸水(自制)；黃柏藥材購于藥材市場,經南京中醫(yī)藥大學藥學院劉圣金老師鑒定。

2 方法與結果

2.1 標準溶液的配制 精密稱取黃柏堿和木蘭花堿標準品適量,置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得含黃柏堿10.1μg·mL-1,木蘭花堿10.7μg·mL-1的混合標準溶液,保存于4℃冰箱內。使用前用流動相稀釋10倍,經孔徑0.45μm濾膜過濾。

2.2 色譜條件 色譜柱:ODS柱(4.6 mm×150 mm, 5μm,Agilent TC-C18),流動相:20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液-乙腈(75∶25,pH4.5),另向流動相中添加2.6 mmol·L-11-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽,流動相使用前經孔徑0.45μm濾膜過濾；流速: 1.0 mL·min-1,檢測波長:280 nm。色譜圖見圖1。

圖1 兩種生物堿的色譜分離圖1.黃柏堿;2.木蘭花堿Fig.1 Chromatographic of two kinds of alkaloids1.phellodendrine;2.magnoflorine

可見,兩種生物堿在給定的色譜條件下得到很好的分離,經計算分離度>1.5,滿足分離測定要求。

2.3 影響因素的考察

2.3.1 pH 黃柏堿、木蘭花堿屬于弱堿［6］,而一般液相色譜柱使用的pH范圍為3～7之間。即在工作pH范圍內,此類生物堿的一部分以質子化酸為主要存在形式,pH越小,質子化酸的比例越高。

分別調節(jié)流動相的pH為3.0,3.5,4.0,4.5,5.0, 5.5,6.0,6.5,7.0,考察組分容量因子(k′)變化。流動相在不同pH條件下,兩組分的保留及變化趨勢見圖2。

圖2 pH對組分保留因子的影響

2.3.2 緩沖溶液的濃度 由于生物堿易質子化,這種質子化過程可能在某一瞬間的局部區(qū)域即可發(fā)生,質子化過程的不確定性可導致在分離過程中色譜峰的失真。所以,生物堿的液相分離大多在一定濃度的緩沖溶液中進行,且保留行為與緩沖液的濃度相關。實驗中分別配制濃度為10～60 mmol·L-1緩沖溶液作流動相,考察組分分離效果。

結果顯示,不同濃度的緩沖溶液作流動相,離子強度不同,分離效率亦不同。當濃度為20 mmol·L-1時,各組分即可達到基線分離,且峰型良好。隨著緩沖溶液濃度的增大,離子強度的增大,各組分的分離效率顯著提高。造成這種現(xiàn)象的原因是由于離子強度的增大,使生物堿極性基團之間的作用力減弱,產生促溶效應,導致色譜柱飽和容量增加,改善分離效果及色譜峰型［7-8］。

但同時也需要注意,離子強度過高,對液相系統(tǒng)的腐蝕損壞程度也隨之增大。因此當分離度達到要求時,離子強度不宜過高。故實驗采用的緩沖溶液濃度為20 mmol·L-1。

2.3.3 緩沖溶液的種類 分別配制20 mmol·L-1醋酸銨與磷酸二氫鈉緩沖溶液作流動相,考察緩沖溶液種類對分離的影響。結果顯示在相同條件下,醋酸銨緩沖液的分離效果較差,見圖3。

圖3 以醋酸銨緩沖溶液作流動相的HPLC色譜圖1.黃柏堿;2.木蘭花堿Fig.3 HPLC chromatogram of alkaloids with mobile phase containing amm onium acetate buffer1.phellodendrine;2.magnoflorine

2.3.5 柱溫 分別設定柱溫為298,303,308,313℃,考察柱溫與組分保留的關系。結果柱溫為298,303, 308,313℃時,黃柏堿lg k′分別為0.709 3,0.698 2, 0.691 4,0.672 3；木蘭花堿的lg k′分別為0.841 4, 0.835 5,0.829 7,0.811 1。

表1 不同離子液體作添加劑分離黃柏堿與木蘭花堿的色譜參數(shù)Tab.1 Chrom atographic parameters for separating phellodendrine and magnoflorine with different ionic liquid as additives

由范特霍夫方程可得容量因子的溫度效應符合如下線性關系:

2.4 黃柏藥材中兩組分的分離 將流動相流速調至0.7 mL·min-1,其他同“2.2”項色譜條件,對黃柏藥材中的兩組分進行分離,進一步驗證該分離方法的可行性。精密稱定黃柏藥材粉末2 g,加甲醇50 mL,超聲處理30 min,冷卻后搖勻靜置,取上清液,使用前經孔徑0.45μm濾膜過濾,即得供試液,分離色譜圖見圖4。

圖4 黃柏的色譜分離圖1.黃柏堿;2.木蘭花堿Fig.4 Chromatograms of phellodendron amurense1.phellodendrine;2.magnoflorine

可見,兩組分在該色譜條件下能夠達到基線分離,能夠滿足分離測定的要求。

3 討論

總之,以離子液體為流動相添加劑,等度洗脫即能實現(xiàn)兩種生物堿的基線分離。影響因素的考察結果表明,隨著流動相pH升高,組分的保留值增大；流動相的離子強度增強、緩沖溶液的緩沖能力降低,組分的分離度增大；離子液體的離液序列升高,柱效增大；組分的保留值與柱溫滿足范特霍夫線性方程,且此法使黃柏藥材中的兩種生物堿達到基線分離,滿足分離測定要求。以上結果均一致表明,在此類生物堿的分離過程中,離子液體在此分離過程中的作用以中性離子對試劑為主。當分離條件不同,組分的保留與分離效果也會相應改變。

［1］潘超,張莉,王玉.HPLC法同時測定二妙丸中黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量[J].中國生化藥物雜志,2012,33(4):361-364.

［2］陳天朝,翟來超.HPLC梯度洗脫測定黃柏中鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量[J].中醫(yī)研究,2011,24(4): 23-25.

［3］BIAN M,ZHANG Z J,YIN H J.Effects and mechanism characterization of ionic liquids as mobile phase additives for the separation of matrine-type alkaloids by liquid chromatography[J].Pharmaceut Biomed,2012,58(1): 163-167.

［4］DYSON P J,SRINIVASAN M C,VINE T,et al.Organometallic synthesis in ambient temperature chloroaluminate (Ⅲ)ionic liquids.Ligand exchange reactionsof ferrocene,[J].J Chem Soc Dalton Trans,1997,19(12):3465-3469.

［5］SUAREZ P A Z,DULLIUS J E L,EINLOFT S,et al.The use of new ionic liquids in two-phase catalytic hydrogenation reaction by rhodium complexes[J]. Polyhedron,1996,15(8):1217-1219.

［6］張蕊,郭寶林.高效毛細管電泳技術用于生物堿的分析[J].中草藥,2005,36(12):1889-1892.

［7］MCCALLEY D V.Overload for ion ized solutes in reversedphase high-performance liquid chromatography[J].Anal Chem,2006,78(8):2532-2535.

［8］MCCALLEY D V.Study of overloading of basic drugs and peptides in reversed-phase high-performance liquid chrom atography using pH adjustment of weak acid mobile phase suitable for mass spectrometry[J].J Chromatogr,2005, 1075(1-2):57.

［9］HE L J,ZHANG W Z,ZHAO L,et al.Effect of 1-alkyl-3-methylim idazolium-based ionic liquids as the eluent on the separation of ephedrines by liquid chromatography[J].J Chromatogr,2003,1007(1):39-45.

［10］RUIZ-ANGEL M J,CARDA-BROCH S,BERTHOD A.Ionic liquids versus triethylam ine asmobile phase additives in the analysis ofβ-blockers[J].J Chromatogr,2006,1119 (1):202-208.

［11］FLIEGER J.The effect of chaotropicmobile phase additives on the separation of selected alkaloids in reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].JChromatogr, 2007,1175(1):207-216.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.028

Mechanism of Ionic Liquids as a Mobile Phase Additives on the Separation of Phellodendrine and Magnoflorine by HPLC

YANG Yong1,BIAN Min2,LIWei2
(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China;2.College of Science,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China)

Objective The chromatographic separation of phellodendrine and magnoflorine was established,and the mechanism of ionic liquid in the process was studied by investigating influencing factors.MethodsPhellodendrine and magnoflorine were isolated by HPLC with 1-butyl-3-methyl imidazole four fluorine boric acid as a mobile phase additive,and mobile phase pH,ionic strength,buffer solution,ionic liquids and column temperaturewere allstudied by investigating the effect of ionic liquid in the process.ResultsIt was shown that the analytes were separated at baseline with a mobile phase containing ionic liquid under 20 mmol·L-1isocratic elution.The retention value,separation and number of theoretical plates varied with the change ofmobile phase.ConclusionIt is clarified that ionic liquid mainly acts as neutral ion pair in the separation of phellodendrine and magnoflorine.

Ionic liquids;Phellodendrine;Magnoflorine;Chromatography,high performance liquid;Additive;Mobile phase

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0096-04

2013-05-07

2013-07-29

*國家自然科學基金資助項目(81073023)

楊勇(1979-),男,陜西韓城人,講師,碩士,主要從事中藥質量控制與管理工作。電話：(0)13770794523,E-mail：leaoyang@163.com。