咪唑立賓對急性Thy1腎炎大鼠系膜細胞p27的影響*

秦福芳，孫倩，邵鳳民

(1.鄭州人民醫(yī)院特需科，鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院腎內科，鄭州 450003)

咪唑立賓對急性Thy1腎炎大鼠系膜細胞p27的影響*

秦福芳1，孫倩1，邵鳳民2

(1.鄭州人民醫(yī)院特需科，鄭州 450003；2.河南省人民醫(yī)院腎內科，鄭州 450003)

目的 觀察咪唑立賓對急性Thy1腎炎大鼠系膜細胞p27的影響。方法雄性SD大鼠90只,分為5組:正常組、模型組、咪唑立賓組、咪唑立賓+氯沙坦組、氯沙坦組,正常組10只,其余各組每組20只。腎炎誘導后第1,3,5,7天取腎臟組織;過碘酸希夫(PAS)染色評估系膜細胞增殖;逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法檢測p27基因表達水平;免疫印跡法(Western blot)檢測p27蛋白表達水平。結果與正常組比較,模型組系膜細胞明顯增殖,p27蛋白表達水平顯著減少(P<0.05);與模型組比較,3個治療組的系膜細胞增殖程度明顯減輕(P<0.05),p27蛋白表達水平顯著增加(P<0.05);咪唑立賓或咪唑立賓聯合氯沙坦的治療作用顯著優(yōu)于單獨應用氯沙坦(P<0.05)。結論咪唑立賓與氯沙坦均可抑制系膜細胞增殖,且咪唑立賓的作用較氯沙坦強,咪唑立賓能夠通過上調p27蛋白表達,從而抑制系膜細胞增殖。

咪唑立賓；Thy1腎炎；系膜細胞；p27

臨床上許多腎小球疾病的病理特征均表現為系膜細胞增殖,因此研究如何抑制系膜細胞增殖具有重要意義。咪唑立賓(mizoribine,MZ)是一種免疫抑制藥,對異常增殖的細胞及各種有絲分裂素引起的細胞分裂具有抑制作用［1］。研究表明咪唑立賓能抑制系膜細胞增殖［2］,p27與系膜細胞增殖成負相關［3］；咪唑立賓抑制系膜細胞增殖是否與p27有關？筆者尚未見相關報道,故在本實驗中制備了急性Thy1腎炎動物模型［4］,觀察咪唑立賓對系膜細胞p27的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠,購自鄭州大學實驗動物中心,體質量:140～160 g；OX-7單克隆抗體(解放軍總醫(yī)院腎臟病研究所惠贈)；咪唑立賓(日本旭化成制藥株式會社提供,批號:H2010122),氯沙坦(杭州默沙東制藥有限公司生產,批號:09022)；大鼠抗小鼠p27單克隆抗體(sc-10621)；辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG(AP021)。引物序列:上游5′-GCA GCT TGC CCG AGT TCT AC-3′,下游5′-TTC TTG GGCGTC TGC TCC AC-3′。

1.2 實驗設計與動物模型制備 雄性Wistar大鼠90只,隨機分為5組:正常組(10只)、模型組(20只)、咪唑立賓組(20只)、咪唑立賓+氯沙坦組(20只)、氯沙坦組(20只)。模型組與治療組給予尾靜脈注射OX-7單克隆抗體(100 mg·kg-1)；正常組注射等量0.9%氯化鈉注射液。注射后6 h開始灌胃給藥,連續(xù)給藥7 d。具體組別及給藥方案如下,正常組:純化水；模型組:純化水；咪唑立賓組:咪唑立賓(20 mg·kg-1)；氯沙坦組:氯沙坦(200 mg·kg-1)；咪唑立賓+氯沙坦組:咪唑立賓(20 mg·kg-1)+氯沙坦(200 mg·kg-1)。病理檢查結果顯示:系膜細胞重度增殖,表明造模成功［4］。

1.3 標本留取 各組大鼠于腎炎誘導后第1,3,5,7天各時間點取腎組織。所取腎組織分別用于過碘酸希夫(periodic acid schiff,PAS)染色、直接免疫熒光檢測、RNA、蛋白質提取及逆轉錄-聚合酶鏈反應(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)、Western blot等分析。

1.4 腎臟常規(guī)病理 采用PAS染色,光鏡觀察,對腎小球內有核細胞數進行計數,每個標本400倍光鏡下觀察100個腎小球。免疫熒光檢測p27陽性細胞數。

1.5 RT-PCR檢測p27mRNA水平 按Trizol試劑盒說明書一步法提取腎組織總RNA,取總RNA 10μg逆轉錄合成cDNA,取cDNA1μL擴增p27的基因片段。PCR總反應體系25μL,含cDNA模板1μL,10×Buffer 2.5μL,2.5 mmol dNTP 1.5μL,25 mmol·L-1氯化鎂(MgCl2)2.0μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,上游及下游引物各0.25μL,加去離子消毒水補至25μL。擴增條件p27:95℃變性45 s,62℃退火45 s,72℃7 min延伸,28個循環(huán)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH):95℃變性45 s, 58℃退火45 s,72℃7 min延伸,26個循環(huán)。置于1.2%瓊酯糖凝膠,電泳。以GAPDH為內參照。采用GDS8000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描分析,計算p27的mRNA及GAPDH-mRNA的比值。

1.6 Western blot檢測p27的蛋白水平 提取腎組織總蛋白質:將凍存腎組織100 mg加入預冷的組織細胞裂解液及蛋白酶抑制劑,勻漿,冰浴1 h,分裝于EP管各約500μL,12 000 r·min-1(r=8 cm)離心15 min, 4℃,取中間層液體,即為所提蛋白。取蛋白100μg上樣；進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干法轉移至聚氟乙烯膜上,加入小鼠p27單克隆抗體(1∶200),4℃過夜。辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG (1∶2 000)作為二抗,室溫搖床1 h。電化學發(fā)光法顯影。β-actin作為內參照,采用Alphaimager 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 正常組、模型組及氯沙坦組大鼠均無明顯異常,體質量逐漸增加。咪唑立賓組及咪唑立賓+氯沙坦組體質量增長稍緩慢,但與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠腎臟病理分析結果 正常組、模型組、咪唑立賓組、氯沙坦組和咪唑立賓+氯沙坦組大鼠腎小球內系膜細胞數分別為(70±8),(130±10),(89± 9),(101±7),(93±8)個。與正常組比較,模型組第4至6天系膜細胞明顯增殖(t=16.48,P<0.01)。咪唑立賓組及氯沙坦組系膜細胞增殖顯著減少(P<0.05)。

2.3 p27mRNA的表達 第3天,各組大鼠之間p27mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 5組大鼠第3天p27mRNA表達A.正常組;B.模型組;C.咪唑立賓組;D.咪唑立賓+氯沙坦組;E.氯沙坦組Fig.1 p27m RNA expression on the third day in five groups of ratsA.normal group;B.model group;C.mizoribine group;D. m izoribine plus losartan group;E.losartan group

2.4 p27蛋白的表達 第3天,與正常組比較,模型組p27蛋白表達顯著減少(t=2.47,P<0.05)；與模型組比較,咪唑立賓組、咪唑立賓+氯沙坦組及氯沙坦組p27蛋白表達顯著增加(t=10.8,t=6.32 t=4.62,P< 0.05)。見圖2。

2.5 各組大鼠p27陽性細胞免疫熒光染色 第3天,與正常組比較,模型組p27陽性細胞數顯著減少(t= 2.57,P<0.05)；與模型組比較,咪唑立賓組、氯沙坦組、咪唑立賓+氯沙坦組p27陽性細胞數顯著增加(P< 0.05)。見圖3。

3 討論

咪唑立賓是一種免疫抑制藥,競爭性抑制嘌呤合成系統(tǒng)中的肌苷酸至鳥苷酸途徑,能夠抑制各種分裂素引起的細胞分裂［1］。體外研究發(fā)現咪唑立賓能夠抑制系膜細胞增殖［5］。氯沙坦是一種血管緊張肽Ⅱ受體拮抗藥,它對系膜細胞增殖的抑制作用已經得到公認,并被應用于系膜增生性腎小球腎炎［6-7］。故本實驗將氯沙坦作為陽性對照藥。觀察咪唑立賓對急性Thy1腎炎大鼠系膜細胞增殖的影響。

圖2 5組大鼠第3天腎組織內p27蛋白表達A.正常組;B.模型組;C.咪唑立賓組;D.咪唑立賓+氯沙坦組;E.氯沙坦組;與正常組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Fig.2 p27m RNA expression in renal tissue on the third day in five groups of ratsA.normal group;B.model group;C.mizoribine group;D. mizoribine plus losartan group;E.losartan group;compared with normal group,*1P<0.05;compared with model group,*2P<0.05

圖3 5組大鼠第3天p27免疫熒光檢測結果A.正常組;B.模型組;C.咪唑立賓組;D.咪唑立賓+氯沙坦組;E.氯沙坦組;與正常組比較,*1P<0.05;與模型組比較,*2P<0.05Fig.3 p27mRNA expression on the third day in five groups of rats by immunofluorescence detectionA.normal group;B.model group;C.m izoribine group;D. mizoribine plus losartan group;E.losartan group;compared with normal group*1P<0.05;compared with model group,*2P<0.05

本研究發(fā)現正常組大鼠系膜細胞幾乎沒有增殖,模型組大鼠系膜細胞大量增殖,而給予咪唑立賓和氯沙坦治療后,系膜細胞輕度增殖或不增殖。且咪唑立賓及聯合用藥的作用優(yōu)于單獨應用氯沙坦。咪唑立賓單獨用藥與聯合用藥之間差異無統(tǒng)計學意義。提示咪唑立賓能夠抑制系膜細胞增殖,并且作用優(yōu)于氯沙坦。該實驗從體內證實了咪唑立賓具有抑制系膜細胞增殖的作用,這一結論與體外研究結論一致［5］。咪唑立賓單獨用藥與聯合用藥之間差異無統(tǒng)計學意義,其原因可能是咪唑立賓通過多種途徑抑制系膜細胞增殖,而氯沙坦可能僅僅從影響血流動力學途徑起作用［8］,具體機制有待進一步研究。

p27為細胞周期調控蛋白中最重要負性調控蛋白,可抑制大多數細胞周期蛋白-周期依賴性蛋白激酶(cyclin-CDK)復合物的激酶活性,對G1期的早期與晚期、S期等各期都有重要作用。許多研究表明p27可抑制系膜細胞增殖［9-10］。大鼠Thy1腎炎中p27與系膜細胞的增生程度呈負相關,早期p27明顯下降,至系膜細胞增生最甚的第5天幾乎不能測及,隨后在系膜細胞停止增殖的恢復期p27水平回復到基礎值,表明p27的下降可使細胞周期從G1期進展到S期,從而產生細胞增殖。CHIARA等［9］研究發(fā)現霉酚酸酯通過上調p27蛋白的表達抑制Thy1腎炎大鼠模型系膜細胞增殖。因此,將p27作為研究靶點很可能對系膜增殖性腎炎的治療有重要的意義。

本研究發(fā)現正常組大鼠p27蛋白表達處于平臺期,模型組p27的蛋白表達水平明顯減少。而給予咪唑立賓及氯沙坦治療后,治療組大鼠p27mRNA水平無明顯變化,p27的蛋白表達水平顯著增加,提示咪唑立賓能夠上調p27蛋白的表達,且咪唑立賓及聯合用藥的作用顯著優(yōu)于單獨應用氯沙坦的作用,但聯合用藥的作用與單獨應用咪唑立賓的作用差異無統(tǒng)計學意義。上述結果還提示氯沙坦也能夠上調p27蛋白的表達抑制系膜細胞增殖。至于咪唑立賓的作用比氯沙坦的作用更強,其機制有待進一步研究。

本研究表明咪唑立賓能夠通過上調p27蛋白表達抑制系膜細胞增殖,為咪唑立賓應用于臨床治療系膜增殖性腎小球腎炎提供重要的理論依據,為臨床治療系膜增殖性腎小球腎炎提供新的治療靶點。

［1］YOKOTA S.Mizoribine:mode of action and effects in clinical use[J].Pediatr Int,2002,44(2):196-198.

［2］秦福芳,閆磊,方歧瑩,等.咪唑立賓對大鼠急性Thy1腎炎腎小球系膜細胞增殖的抑制作用[J].中華實用診斷與治療雜志,2011,25(12):1185-1187.

［3］章道恒,李富榮,齊暉,等.細胞周期調節(jié)負控蛋白p27在腎小球系膜細胞增殖中的調控作用[J].中國現代醫(yī)學雜志,2004,14(10):98-101.

［4］王海燕.腎臟病學[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2008:610.

［5］LIU S,XIE Y,LV Y,et al.A novel target of mizoribine inhibiting mesangial cell proliferation:S phase kinaseassociated protein 2[J].Am JNephrol,2010,32(5):447-455.

［6］SHANKLAND S J,WOLF G.Cell cycle regulatory proteinsin renal disease:role in hypertrophy,proliferation and apoptosis[J].Am JPhysiol,2000,278(4):515-529.

［7］GRIFFIN SV,PICHLER R,DITTRICH M,et al.Cell cycle control in glomerular disease[J].Springer Semin Immunopathol,2003,24(4):441-457.

［8］JIAO S,ZHENG X,YANG X,et al.Losartan inhibits STAT1 activation and protects human glomerular mesangial cells from angiotensinⅡinduced premature[J].Can J Physiol Pharmacol,2012,90(1):89-98.

［9］CHIARA M,MENEGATTIE,DISIMONE D,et al.Mycophenolate mofetil and roscovitine decrease cyclin expression and increase p27(kip1)expression in anti Thy1mesangial proliferative nephritis[J].Clin Exp Immunol,2005,139 (2):225-235.

［10］IANCU-RUBIN C,ATWEH G F.p27(Kip1)and stathmin share the stage for the first time[J].Trends Cell Biol, 2005,15(7):346-348.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.004

Effect of Mizoribine on p27 of Mesangial Cells in Rats with Acute Thy1 Nephritis

QIN Fu-fang1,SUN Qian1,SHAO Feng-min2
(1.Special Wards,People′s Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450003,China;2.Department of Nephrology,Henan Provincial People′s Hospital,Zhengzhou 450003,China)

Objective To study the effect of mizoribine(MZ)on p27 of mesangial cells in rats with acute Thy1 nephritis.MethodsNinety male rats were random ly divided into five groups,which were normal,nephritic,mizoribine treated,losartan treated,bothmizoribine and losartan treated groups.Each group had 20 ratsexcept for normal group,which had ten rats.The nephritismodel was induced and renal tissue was removed 1,3,5,7 days aftermodel was established.Mesangial cells proliferation was determined by PAS staining.The expression of p27mRNA was detected by RT-PCR,and the protein expression was tested by western blotting.ResultsCompared with the control,themesangial cells proliferation in the nephritis model group was remarkably increased,but the expression of p27 protein was decreased significantly(P<0.05).Compared with the nephritis models,treatment with MZ,losartan or MZ p lus losartan showed an obvious inhibition of the mesangial cells proliferation(P<0.05),but significantly up-regulated expression of p27 protein(P<0.05),especially with the treatment of mizoribine,and losartan plus mizoribine.(P<0.05).ConclusionBoth mizoribine and losartan can inhibit mesangial proliferation in Thy1 nephritis,and the effect ofmizoribine ismore remarkable by up-regulation of the expression of p27 protein.

Mizoribine;Thy1 nephritis;Mesangial cell;p27

R979.5;R965

A

1004-0781(2014)01-0013-04

2012-11-23

2013-05-07

*河南省科技攻關基金資助項目(112102310127)

秦福芳(1974-),女,河南新鄉(xiāng)人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:慢性腎小球腎炎的發(fā)病機制。電話：0371-67077327,E-mail：qinfufang1781@126.com。