射干合劑灌胃后大鼠尿及糞便中6種成分含量*

唐躍年,張健,陸曉彤,陳婷,魏昕,金樑,孫朝榮,胡松浩,楊傳敏,嚴(yán)云

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科,上海 200092)

射干合劑灌胃后大鼠尿及糞便中6種成分含量*

唐躍年,張健,陸曉彤,陳婷,魏昕,金樑,孫朝榮,胡松浩,楊傳敏,嚴(yán)云

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科,上海 200092)

目的 了解大鼠灌胃射干合劑后,指標(biāo)成分在大鼠血清內(nèi)吸收及其在大鼠尿、糞中24 h排泄情況。方法采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定化合物的含量,大鼠代謝籠技術(shù)。結(jié)果給予射干合劑后24 h指標(biāo)成分基本從大鼠體內(nèi)排泄完。結(jié)論麻黃堿在大鼠體內(nèi)24 h基本排泄,黃酮類化合物在體內(nèi)有互相轉(zhuǎn)化的可能。服用射干合劑不會(huì)造成體內(nèi)麻黃堿及黃酮類化合物的蓄積。

射干合劑;黃酮類化合物;麻黃堿;排泄;含量測(cè)定

射干合劑(Sheganheji,SGHJ)由射干、麻黃、杏仁、蔊菜、僵蠶、前胡、蟬衣、百部、黃芩9味中藥組成,可宣肺清熱,止咳祛痰平喘。其中麻黃具有平喘功效,黃酮類化合物有清熱作用。SGHJ指紋圖譜分析,SGHJ的可測(cè)定化合物主要為麻黃堿和黃酮類化合物[1]。目前,對(duì)SGHJ的成分及臨床療效研究較多,但有關(guān)的成分研究大多只限于成分的定性、定量分析,針對(duì)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究很少;有關(guān)藥效研究也多集中在臨床療效方面。SGHJ在體內(nèi)到底以何種成分、何種形式發(fā)揮作用以及作用機(jī)制如何,至今尚無(wú)明確的研究報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)中建立動(dòng)物血清SGHJ多指標(biāo)成分測(cè)定方法的基礎(chǔ)上[2],給大鼠口服灌胃SGHJ并測(cè)定血清、尿及糞便中指標(biāo)成分變化[2],為進(jìn)一步確定射干合劑藥效的物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大白鼠,體質(zhì)量(200±35)g,雌雄各半;由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(滬)2008-0052,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2004-0001;空白血清、尿液、糞便均采自未服用目標(biāo)物的動(dòng)物。

1.2 試劑 黃芩苷(baicalin,BCL,批號(hào):110715-200815,含量:95.2%)、黃芩素(baicalein,BCN,批號(hào): 111595-200905,含量:98.5%)、漢黃芩素(wogonin, WG,批號(hào):111514-201003,含量:98.3%)、射干苷(belamcandin,BLC,批號(hào):111632-201001,含量: 98.7%)、次野鳶尾黃素(irisflorentin,IFR,批號(hào): 111557-201002,含量:≥98.8%)、鹽酸麻黃堿(ephedrine hydrochloride,ED,批號(hào):171241-201007,含量:99.7%)、鹽酸硫利達(dá)嗪(thioridazine hydrochloride, TD,批號(hào):100344-201002,含量:95.2%)都購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,均為對(duì)照品;SGHJ(上海美優(yōu)制藥廠,批號(hào):11120,規(guī)格:每瓶100 mL);甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Tedia公司);水為雙蒸水。其余試劑均為分析純,全部溶劑均采用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3 儀器 Agilent 6460串聯(lián)四極桿質(zhì)譜, Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)惠普公司);Labofuge 400R高速離心機(jī)(上海力新有限公司);XW-80型旋渦混合器(原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);Olympus BX50光學(xué)顯微鏡(Olympus公司);pHS-3TC精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);As3120B超聲波清洗器(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 分析柱:Capcell C18MGⅢ(2 mm× 100 mm,5 μm)[資生堂(中國(guó))投資有限公司生產(chǎn)];保護(hù)柱:C18(4.0 mm×3.0 mm,5 μm)(美國(guó)Phenomenex公司)。流動(dòng)相A為水,流動(dòng)相B為乙腈,A∶B=95∶5 (V/V),二元線性梯度洗脫[0～0.5 min,A∶B(95%∶5%);～5 min,A∶B(95%∶5%)→A∶B(10%∶90%);～6.5 min,A∶B(10%∶90%)→A∶B(95%∶5%)→～10 min,A∶B(95%∶5%)]。流速: 0.3 mL·min-1;進(jìn)樣體積5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子掃描;霧化氣: 50 kPa,氣簾氣:20 kPa,碰撞氣:48 kPa,離子源電壓: 4 500 V,離子源溫度:500℃,為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式。在上述色譜、質(zhì)譜條件下,通過(guò)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化,分別得到BCL、BCN、WG、BLC、IFR、ED和內(nèi)標(biāo)TD的離子選擇通道分別為m/z447.2→271.2、m/z271.2→123.2、m/z285.2→270.2、m/z463.2→301.2、m/z387.1→357.1、m/z166.2→148.2、m/z371.2→126.2。

2.3 對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制 分別取對(duì)照品BCL、BCN、WG、BLC、IFR、ED和內(nèi)標(biāo)TD適量精密稱定,置100 mL量瓶中。用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mg·mL-1,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 SGHJ中指標(biāo)成分的含量測(cè)定 取SGHJ 1 mL加甲醇至10 mL,混勻,離心,取上清液為100 μL,用雙蒸水稀釋至1 mL,混勻,然后取內(nèi)標(biāo)為10 μL (0.1 μg·mL-1),加稀釋液10 μL,再加水80 μL,混勻,0.22 μm濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣體積5 μL;將測(cè)定值代入各自標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到SGHJ中指標(biāo)成分的含量及動(dòng)物給藥量。見表1。

2.5 空白血清及含藥血清、尿液、糞便樣品的制備血清:取空白和給藥血0.3 mL,血清在3 000 r·min-1條件下離心10 min,取血清45 μL,加內(nèi)標(biāo)5 μL混勻,加甲醇150 μL,旋渦振蕩,離心,上清液10 μL加水50 μL稀釋進(jìn)樣測(cè)定。尿液:取空白和給藥尿樣,用甲醇稀釋體積10倍,離心,然后取內(nèi)標(biāo)10 μL (0.1 μg·mL-1),加稀釋尿液10 μL,再加水80 μL,混勻,進(jìn)樣,最終濃度相當(dāng)于稀釋了100倍。糞便:稱取空白和給藥糞便約0.1 g,加甲醇1 mL,超聲處理30 min,離心,然后取內(nèi)標(biāo)100 μL(0.1 μg·mL-1),加稀釋液5 μL,再加水895 μL,混勻,進(jìn)樣,最終濃度相當(dāng)于稀釋200倍。

2.6 各化合物線性范圍及檢測(cè)限 分別取“2.3”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液,制備BCL、BCN、WG、BLC、IFR、ED標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)及最低檢測(cè)限分別為,BCL:Y= 4.364×10-3+5.217×10-3X,r=0.999 5,LOD= 0.01 ng·mL-1;BCN:Y=5.436×10-3+7.221×10-3X,r=0.999 4,LOD=0.01 ng·mL-1;WG:Y=6.632× 10-3+5.374×10-3X,r=0.998 7,LOD=0.05 ng·mL-1; BLC:Y=5.736×10-3+6.638×10-3X,r=0.999 9,LOD= 0.05 ng·mL-1;IFR:Y=7.362×10-3+8.123×10-3X,r= 0.999 3,LOD=0.05 ng·mL-1;ED:Y=9.536×10-3+ 5.253×10-3X,r=0.998 9,LOD=0.05 ng·mL-1。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 分別取空白血清、尿液、糞便若干份;配制BCL、BCN、WG、BLC、IFR、ED低、中、高3個(gè)濃度[分別為5,100,500 ng·mL-1]的質(zhì)控樣品,每一濃度取6份,按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品預(yù)處理,按“2.1”項(xiàng)下LC-MS/MS條件進(jìn)樣測(cè)定,得上述化合物峰面積,以血清、尿液、糞便中各化合物的峰面積與水中各化合物峰面積相比×100%,得各化合物提取回收率89.6%～92.1%,87.4%～90.3%,79.9%～92.3%,88.3%～95.2%,83.4%～93.4%,85.2%～94.6%;RSD(n=6)均小于12.1%[2]。

2.8 精密度與準(zhǔn)確度 按“2.3”項(xiàng)方法,制備BCL、BCN、WG、BLC、IFR、ED低、中、高3個(gè)濃度[分別為5, 100,500 ng·mL-1]的質(zhì)控樣品,每一濃度取6份,連續(xù)測(cè)定3 d,計(jì)算方法精密度與準(zhǔn)確度,RSD均小于15.0%[2]。

2.9 動(dòng)物的給藥及體內(nèi)化合物的測(cè)定 取SD大鼠12只,每只大鼠單劑量口腔灌胃SGHJ 1 mL·(100 g)-1,分別放入代謝籠中,分別在給藥后2 h靜脈采血0.3 mL;并收集大鼠24 h尿液、糞便;按“2.5”項(xiàng)方法處理,測(cè)定動(dòng)物血清、尿液、糞便中指標(biāo)成分的含量。

2.10 SGHJ給藥后指標(biāo)成分在尿液、糞便中的回收情況 大鼠灌胃SGHJ后,收集24 h尿液、糞便按“2.5”項(xiàng)方法處理后,測(cè)定的化合物與大鼠血清中化合物相同;但是在尿液、糞便中的回收率有很大的差異。見表1。

2.11 SGHJ血中指標(biāo)成分吸收 各指標(biāo)成分在制劑及大鼠吸收后血中濃度。見表2。

表1 SGHJ給藥24 h后指標(biāo)成分在大鼠尿液、糞便中回收情況Tab.1 Recovery of marker components in SGHJ in urine and feces of rats 24 h after SGHJ treatment

表2 SGHJ中指標(biāo)成分含量2 h后在大鼠血中濃度Tab.2 Content of marker components in SGHJ and their blood level in 12 rats 2 h after SGHJ treatment

3 討論

實(shí)驗(yàn)得知:SGHJ指標(biāo)成分中BCL、BCN、WG、ED可被大鼠吸收進(jìn)入血液,而BLC、IFR在動(dòng)物給藥后未能在體內(nèi)血液、糞便和尿液中也檢測(cè)到,可能是濃度太低所致;ED在吸收進(jìn)入體內(nèi)24 h基本從尿中回收,糞便中不能測(cè)得。說(shuō)明ED主要經(jīng)由腎臟排泄;BCL可在消化道內(nèi)吸收,部分在尿中排泄,極少量在糞便中排泄;BCN能被消化道吸收,部分從尿液、糞便中排泄; WG吸收后,尿中、糞便中都有回收,并超過(guò)給藥量,說(shuō)明黃酮類化合物在體內(nèi)存在相互轉(zhuǎn)化的可能。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,ED在體內(nèi)不會(huì)蓄積,24 h內(nèi)基本可排出體外,而黃酮類化合物在體內(nèi)的變化較為復(fù)雜,種類繁多。中藥黃芩中就含有:BCL、BCN、WG、漢黃芩苷、野黃芩苷、黃芩新素Ⅰ、黃芩新素Ⅱ、白黃楊素、千層紙黃素A、粘毛黃芩素Ⅰ、粘毛黃芩素Ⅲ等,需要更全面地測(cè)定各種黃酮類化合物在體內(nèi)的變化,才能進(jìn)一步了解各成分之間可能存在互相轉(zhuǎn)化的過(guò)程[3-4]。本實(shí)驗(yàn)僅測(cè)定了部分的黃酮類化合物,不能對(duì)它們之間的轉(zhuǎn)變有明確的結(jié)論,其互相轉(zhuǎn)變的過(guò)程需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1] 唐躍年,金樑,張青,等.射干合劑的HPLC-UV指紋圖譜分析[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2012,21(5):283-286.

[2] 唐躍年,陳婷,魏昕,等.LC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物血清中射干合劑多指標(biāo)成分的濃度[J].中國(guó)藥師,2013,16(2): 190-193.

[3] 陶巧鳳,趙昱,羅旭.RP-HPLC測(cè)定黃芩素及其代謝產(chǎn)物黃芩苷大鼠血漿濃度[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2007,42(12): 929-932.

[4] 劉太明,蔣學(xué)華,張梅娟,等.黃芩苷和黃芩素的大鼠在體腸吸收特性[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2006,41(23):1784-1787.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.002

Content of Six Compounds in Urine and Feces After Intragastric Administration of Shegan Heji in Rat

Objective To study absorption ofshegan hejimarker components in blood and their excretion in urine and feces of rats,after intragastric administration ofshegan heji.MethodsLC-MS/MS was used for determination of marker compounds.Rat metabolic cage technology was employed.ResultsExcretion of marker components were completed 24 hours after administration.ConclusionEphedrine can be excreted from rats within 24 hours.The possibility of mutual transformation of flavonoids exists in the body.Takingshegan hejiwill not cause accumulation of ephedrine and flavonoids in the body.

Shegan heji;Flavonoids;Ephedrine;Excretion;Content determination

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-0985-03

2013-07-30

2014-01-16

*上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金資助項(xiàng)目(2012G003A);上海市科委基金資助項(xiàng)目(11D21972500)

唐躍年(1956-),男,上海人,副主任藥師,研究方向:中藥學(xué)。電話:021-25077162,E-mail:tyn2018@163.com。

嚴(yán)云(1964-),女,上海人,主任醫(yī)師,學(xué)士,研究方向:血液病。電話:021-25077160,E-mail:yy13651706181 @163.com。

TANG Yue-nian,ZHANG Jian,LU Xiao-tong,CHEN Ting,WEI Xin,JING Liang,SUN Chao-rong,HU Songhao,YANG Chuan-min,YAN Yun(Department of Pharmacy,Xinhua Hospital Affiliated to Medical College,Shanghai Jiaotong University,Shanghai200092,China)