羅非魚魚皮膠原肽-葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備及其抗氧化活性*

劉蒙蒙，楊美智子，孫云，孫麗平，莊永亮

(昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院食品工程研究中心，云南昆明，650500)

近年來，開發(fā)食源性活性肽作為食品天然抗氧化劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。但是食源性活性肽普遍存在味苦、抗氧化性能不全面的缺陷。Dong等［1］研究認(rèn)為，美拉德反應(yīng)(Maillard reaction，MR)可以掩蔽酪蛋白肽的苦味;Liu等［2］發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白水解物的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)表現(xiàn)高于水解物的還原能力、DPPH自由基清除活性和Fe2+螯合活性;Guerard等［3］研究表明，加熱酪蛋白胨和鱈魚內(nèi)臟水解物與葡萄糖的混合物，加熱產(chǎn)物對自由基清除活性相比水解液本身提高了75%。

羅非魚(Oreochromis niloticus)是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚種，加工過程中產(chǎn)生了大量的皮、骨等副產(chǎn)物。前期的研究中制備了具有抗氧化活性的羅非魚魚皮膠原肽［4］。本文以前期制備的羅非魚魚皮膠原肽為原料，制備了不同條件下的膠原肽-葡萄糖的美拉德反應(yīng)體系，對體系的pH值變化、MRPs在294 nm處的吸光值、褐變程度、熒光強(qiáng)度以及體系中游離氨基基團(tuán)的含量進(jìn)行了跟蹤測定，進(jìn)一步對MRPs的抗氧化活性進(jìn)行了分析，以期對不同條件下美拉德反應(yīng)對羅非魚魚皮膠原肽的影響進(jìn)行評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

未分級的羅非魚魚皮膠原肽由前期實(shí)驗(yàn)制備［4］。

KW1000DC型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司;TDL－40B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司;TU－1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多(上海)有限公司;RF－5310PC熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 不同條件下魚皮膠原肽-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系的制備

用0.2 mol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液制備膠原肽溶液，濃度為25mg/mL，利用茚三酮比色法［5］測定溶液中游離氨基的摩爾濃度，以此濃度為基礎(chǔ)，加入葡萄糖，使體系中氨基與羰基的比例為1∶0.5、1∶1和1∶2，在后面的部分分別表示為 TSGP/G 1∶1，TSGP/G 1∶0.5，和 TSGP/G 1∶2。將溶液分別轉(zhuǎn)移至 25mL 螺旋密封管中(German Schott)，80℃的水浴加熱12 h，分別于 0，1，3，6，12h 取樣，立即冷卻，取部分 MRPs用于測定pH值和游離氨基濃度，其余MRPs保存于4℃下備用。不添加葡萄糖的TSGP作為對照試驗(yàn)。

1.3 MRPs的光度分析

按照孫麗平等［6］的方法測定不同條件下MRPs的紫外吸光值、褐變強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度。

1.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH·清除活性的測定

取0.4 mL不同反應(yīng)體系的MRPs，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，混勻，暗處放置30 min并不斷振蕩，在517 nm處測其吸光度。0.4 mL水+2 mL甲醇為空白，0.4 mL蒸餾水代替樣品為對照。常用抗氧化劑Vc作為陽性對照。清除率計(jì)算公式為:

1.4.2 OH·清除活性的測定

取1.0 mL不同反應(yīng)體系的MRPs，依次加入0.3 mL 8.0 mmol/L FeSO4溶液，0.25 mL 20 mmol/L H2O2溶液和1.0 mL 3.0 mmol/L水楊酸溶液，混勻，37℃水浴30 min，取出流水冷卻，加入0.45 mL蒸餾水，使體系最終保持3.0 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液于510 nm處測定吸光值。1.0 mL蒸餾水代替水楊酸溶液為樣品對照，1.0 mL蒸餾水代替樣品+1.0 mL蒸餾水代替水楊酸溶液為空白調(diào)零，1.0 mL蒸餾水代替樣品為對照。清除率計(jì)算公式為:

1.4.3 ABTS自由基清除活性的測定

將5 mL 7 mmol/L ABTS和88 μL 的140 mmol/L過硫酸鉀混合，在室溫，避光的條件下靜置12 h，形成ABTs·儲(chǔ)備液。該儲(chǔ)備液在室溫，避光的條件下穩(wěn)定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃下、734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。

取0.5 mL不同反應(yīng)體系的 MRPs，加入 4 mL ABTS·工作液充分混合10 s，30℃水浴6 min，于734 nm波長處測吸光度。0.5 mL無水乙醇+4 mL ABTS+·工作液，在0 min時(shí)的吸光值為對照，0.5 mL水+4 mL無水乙醇為空白調(diào)零。不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液(0，40，80，120，160 μmoL/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。清除率計(jì)算公式為:

清除活性以Trolox當(dāng)量表示。

1.4.4 還原能力的測定

取1.0 mL不同反應(yīng)體系的MRPs，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴20 min，取出，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，迅速冷卻。取1.0 mL混合液于5.0 mL離心管中，加入1.0 mL超純水和0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，測定溶液在700 nm處的吸光度(A700)。Vc作為陽性對照。蒸餾水代替樣品作為空白調(diào)零。以A700表示樣品的還原能力。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±偏差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5軟件(P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著)。

2 結(jié)果和討論

2.1 pH值的變化

在美拉德反應(yīng)中，pH值至關(guān)重要，因?yàn)轸拾笨s合是一個(gè)可逆的過程，羰氨縮合過程中封閉了游離的氨基，反應(yīng)體系pH值下降，所以堿性條件有利于初始的羰氨縮合反應(yīng)［7］。本研究美拉德反應(yīng)體系pH值變化如圖1所示。反應(yīng)1h后，除TSGP外，所有體系的pH值均出現(xiàn)顯著的下降趨勢(P＜0.05)，隨后，pH值下降緩慢，直至反應(yīng)結(jié)束。TSGP/G 1∶2中pH值下降幅度最大，表明較高的葡萄糖濃度產(chǎn)生相對較高的pH值降低，這一結(jié)果與王惠英等［8－9］的結(jié)果一致。美拉德反應(yīng)中pH值的降低也可能是由于反應(yīng)過程中產(chǎn)生了有機(jī)酸，如甲酸和乙酸［10］。

2.2 MRPs光度的變化

美拉德反應(yīng)的小分子中間產(chǎn)物具有強(qiáng)紫外光吸收和熒光，294 nm光吸收是由糖裂解產(chǎn)生的酮、醛類等無色小分子物質(zhì)產(chǎn)生的，美拉德體系中熒光強(qiáng)度與紫外光吸收強(qiáng)度的發(fā)展表現(xiàn)為不同的動(dòng)力學(xué)行為，所以熒光小分子物質(zhì)被認(rèn)為是不同于具有紫外光吸收物質(zhì)的小分子產(chǎn)物［6］。褐變強(qiáng)度(420 nm處的吸光值)是一個(gè)用于評價(jià)美拉德反應(yīng)進(jìn)程的非特定性參數(shù)，這主要是美拉德反應(yīng)后期產(chǎn)生了高分子褐色化合物類黑素，其在420 nm處有最大特征性吸收［11］。本研究體系中MRPs在294 nm的吸光值(A294)、褐變強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度的變化如圖2所示。隨加熱時(shí)間的增加，除TSGP外，所有美拉德反應(yīng)體系的A294、褐變強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度均顯著增加(P＜0.05)。

由圖2(a)可以看出，TSGP/G 1∶2體系的 MRPs的A294顯著高于 TSGP/G 1∶1和 TSGP/G 1∶0.5(P＜0.05)。加熱 12h后，TSGP/G 1∶2體系 MRPs的A294表現(xiàn)最大的增加值，其次是TSGP/G 1∶1和TSGP/G 1∶0.5。從本結(jié)果可以看出，美拉德反應(yīng)中葡萄糖濃度越高，反應(yīng)越快。同樣的，TSGP/G 1∶2體系的MRPs具有最大的褐變強(qiáng)度，隨后是TSGP/G 1∶1和TSGP/G 1∶0.5。童彥等［12］發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖添加量的增加，420 nm處吸光值(褐變強(qiáng)度)不斷增加，說明葡萄糖不斷參與美拉德反應(yīng)，褐色物質(zhì)不斷生成，反應(yīng)程度持續(xù)加深。從結(jié)果可以看出，所有樣品的褐變強(qiáng)度隨A294的增加而增加。一般來說，中間階段的紫外吸收和無色化合物引起美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)中褐色色素的形成［13］。在任一反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，TSGP/G 1∶2的熒光強(qiáng)度均大于TSGP/G 1∶0.5和TSGP/G 1∶1，與A294和褐變強(qiáng)度的變化趨勢相似。美拉德反應(yīng)中熒光化合物的形成先于褐色色素的產(chǎn)生［14］。熒光化合物可能是褐色色素的前體［15］。

圖2 MRPs在294nm下的吸光值(a)、褐變強(qiáng)度(b)和熒光強(qiáng)度(c)隨加熱時(shí)間的變化Fig.2 Changes in absorbance at 294 nm(a)，browning intensity(b)and fluorescence intensity(c)of MRPs as function of heating time

2.3 游離氨基濃度的變化

美拉德反應(yīng)體系中游離氨基濃度隨加熱時(shí)間的變化如圖3所示。反應(yīng)3 h內(nèi)，含有不同濃度葡萄糖的TSGP-G體系中游離氨基的濃度顯著下降(P＜0.05)，隨后，隨加熱時(shí)間的增加，各體系中游離氨基的含量出現(xiàn)不同程度的變化，TSGP/G 1∶2體系中MRPs的游離氨基含量隨加熱時(shí)間的增加而持續(xù)降低。加熱12 h 后，TSGP/G 1∶0.5，TSGP/G 1∶1和 TSGP/G 1∶2體系中減少的游離氨基含量分別為23.60%，25.62%和33.11%。單獨(dú)加熱的TSGP中游離氨基含量也隨加熱時(shí)間的增加而減少，但不明顯。結(jié)果表明，葡萄糖濃度越高，參與反應(yīng)的游離氨基含量越多，即美拉德反應(yīng)越能高效地發(fā)生。此結(jié)果與Dong等［1］的結(jié)果一致。另外，游離氨基含量的降低與A294和褐變強(qiáng)度的增加(圖2)存在正相關(guān)性。Zeng等［16］也發(fā)現(xiàn)游離氨基基團(tuán)的損失和褐變程度之間存在相關(guān)性。

圖3 反應(yīng)體系中游離氨基含量隨加熱時(shí)間的變化Fig.3 Changes in free amino group content of Maillard reaction system as function of heating time

2.4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除活性

MRPs對DPPH·的清除活性隨加熱時(shí)間的變化如圖4(a)所示。TSGP具有相對較低的DPPH·清除活性，并且不受加熱時(shí)間的影響(P＞0.05)。加熱6h內(nèi)，所有MRPs的DPPH·清除活性均顯著增加(P＜0.05)。加熱至12h 時(shí)，TSGP/G 1∶0.5，TSGP/G 1∶1和TSGP/G 1∶2的活性分別達(dá)到88.97%，94.61%和95.17%，相當(dāng)于11.11～11.86 μg/mL的常見抗氧化劑Vc。本研究中，TSGP/G 1:2體系中的 MRPs的DPPH·清除活性在各加熱時(shí)間點(diǎn)均高于TSGP/G 1∶0.5和TSGP/G 1∶1，這說明，美拉德反應(yīng)體系中葡萄糖濃度越高，產(chǎn)生的MRPs的自由基清除活性越高。這一結(jié)果與王惠英等［8］的結(jié)果一致。有學(xué)者報(bào)道，褐變強(qiáng)度與DPPH·清除活性相關(guān)［7］。

2.4.2 羥自由基清除活性

如圖4(b)所示，隨加熱時(shí)間和葡萄糖濃度的變化，MRPs的羥自由基清除活性無顯著差異(P＞0.05)。這一現(xiàn)象可能是由于MRPs的金屬螯合活性［17－18］。MRPs的螯合能力取決于其濃度以及體系中的金屬，金屬濃度越高，MRPs結(jié)合位點(diǎn)飽和，從而干預(yù)了它進(jìn)一步的抗氧化能力［19－20］。因此，在羥自由基清除活性中，MRPs的金屬螯合能力干預(yù)了其羥自由基清除活性。在Vhangani等［10］的研究中，核糖-賴氨酸和果糖-賴氨酸模擬體系MRPs的羥自由基清除活性無顯著差異，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4.3 ABTS自由基清除活性

由如圖4(c)可以看出，所有MRPs的ABTS自由基清除活性均隨加熱時(shí)間的增加而顯著增加(P＜0.05)。且TSGP/G 1∶2表現(xiàn)最高的清除活性，其次為TSGP/G 1∶1，TSGP/G 1∶0.5 的活性較低，但仍高于單獨(dú)加熱的TSGP對照組的活性。TSGP/G 1∶0.5，TSGP/G 1∶1和 TSGP/G 1∶2加熱 12 h 得到的 MRPs的 ABTS自由基活性分別為 148.82，164.32和176.03 μmol/mL Trolox當(dāng)量。MRPs的ABTS自由基清除活性與DPPH自由基清除活性［圖4(a)］表現(xiàn)相似的趨勢。Zeng等［16］也發(fā)現(xiàn)，MRPs具有ABTS自由基清除活性，且清除活性隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。

2.4.4 還原能力

由圖4(d)可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，各體系MRPs的還原能力也隨之增加，TSGP/G 1∶2體系中MRPs的還原能力增強(qiáng)的最為明顯，加熱至6 h時(shí)還原能力已相當(dāng)于145.03 μg/mL Vc。而對照組TSGP的還原性沒有隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。Zeng等［16］也報(bào)道，在整個(gè)美拉德反應(yīng)過程中，MRPs的還原能力隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。

圖4 MRPs的DPPH·(a)、OH·(b)和ABTS+·(c)清除活性以及還原能力(d)隨加熱時(shí)間的變化Fig.4 Changs of DPPH radical(a)，hydroxyl radical(b)and ABTS radical(c)scavenging activities，and reducing power of MRPs as function of heating time

3 結(jié)論

結(jié)果表明，羅非魚魚皮膠原肽-葡萄糖的美拉德反應(yīng)是一個(gè)酸度和褐變不斷增強(qiáng)的反應(yīng)過程。在相同反應(yīng)條件下，TSGP/G 1∶2體系美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度、自由基清除活性、還原能力均強(qiáng)于 TSGP/G 1∶0.5 和 TSGP/G 1∶1體系的 MRPs。同時(shí)，除羥自由基清除活性外，羅非魚魚皮膠原肽的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性均顯著優(yōu)于膠原肽。

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