黑蒜中呈色物質5-羥甲基糠醛的分離鑒定及其生成動力學*

卜利偉，邱瑞霞，黃雪松

(暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州，510632)

黑蒜(black garlic)是在控制環(huán)境中溫度和濕度的情況下，新鮮大蒜(Allium sativum L.)自然發(fā)酵而成的產品［1］。在黑蒜加工過程中，新鮮大蒜先在低溫條件下熟化一定時間后，再高溫熟化成最終產品，其中低溫熟化階段主要發(fā)生酶促反應，而高溫熟化階段主要發(fā)生非酶褐變反應，包括Maillard反應、焦糖化反應、Vc氧化分解等［2］。這些反應產生的一些褐變產物使黑蒜擁有了相對于新鮮大蒜更加豐富的功能成分和更強的生物活性［3］。而這些反應所產生的一些呈色物質使得新鮮大蒜的顏色從自然白色漸變?yōu)辄S色、咖啡色到最終的黑色［4］。

成熟的黑蒜兼具黑色和強生物活性，可見黑蒜的呈色物質與品質之間應當存在一定關系，此外，呈色物質本身也有一些生物活性，如類黑精的抗氧化特性［5］，5-HMF可治療內毒素血癥及降低因此誘發(fā)的多臟器功能衰竭所致死亡等方面的作用［6］。郭彩華［7］等證實黑醬油中類黑素粗制品對DPPH自由基的清除率最高達89.0%，對羥自由基的清除能力達89.5%，而類黑素正是黑醬油呈色的主要物質。因此，如果了解了黑蒜生產中某種呈現(xiàn)黑色物質的生成規(guī)律，便可以利用呈色物質和黑蒜品質之間的函數(shù)關系在黑蒜加工的過程中對黑蒜的品質進行監(jiān)控。為此，本文將對黑蒜中主要呈色物質進行分離鑒定，并通過不同溫度等處理研究其生成規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

新鮮大蒜，產自山東省金鄉(xiāng)縣，購自廣州市天河區(qū)石牌蔬菜市場;購自Dikma公司的色譜純甲醇;無水乙醇(分析純)，購自廣州化學試劑廠;5-HMF(98.0%)購自 Sigma公司;所有用水均為Mili-Q純化系統(tǒng)純化水。

1.2 儀器與設備

FHS-2A可調高速勻漿機，金壇市宏華儀器廠;DHG-9070A烘箱，上海一恒科技有限公司;Prominence LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司;4000 Qtrap四極桿-線性阱復合型質譜儀，美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 樣品前處理

第一階段:凍結，將樣品(3 kg新鮮大蒜分裝到100個小袋，每袋30 g)放入－70℃冰箱冷凍48 h。

第二階段:低溫熟化，從－70℃冰箱中取出樣品放入45℃恒溫烘箱里，熟化72 h，期間每隔8 h取出2袋樣品，測定物料中的5-HMF含量。

第三階段:高溫熟化，從低溫熟化后的樣品中取72袋樣品平均放進3個恒溫烘箱中，溫度分別設定為70，80和90℃，熟化72 h，期間每個烘箱每隔8 h取出2袋樣品，測定物料中的5-HMF含量(2袋樣品的平均值)。

1.4 黑蒜呈色物質的分離鑒定

將150 g活化后的硅膠裝入燒結漏斗中(內徑10 cm，長15 cm)。取一定量的黑蒜樣品經破碎、離心后，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液旋蒸濃縮至一定體積，然后濃縮液與15 g活化后的硅膠合并在一起濃縮干燥得到硅膠和樣品的混合物。將其均勻鋪在150 g硅膠表面，以100 mL的石油醚-乙酸乙酯(體積比=1∶1)為初始洗脫液，不斷增加初始洗脫液中的甲醇比例來提高極性進行減壓洗脫，每100 mL收集一瓶，共收集21瓶洗脫液。

1.5 黑蒜呈色物質的ESI-MS鑒定

將真空柱分離后的第4瓶洗脫液中黑色物質進行ESI-MS鑒定，質譜條件為離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式EI;電子能量70 eV，溶劑延遲時間為2 min，采用正離子模式，掃描質量范圍20～500 m/z，采集方式為掃描，質量分析數(shù)據庫為Nist 9811。

1.6 加5-HMF內標鑒定黑蒜中的呈色物質

將真空柱分離后的第4瓶洗脫液分成2份(1份加入一定濃度的5-HMF標準品，1份不加)，然后用HPLC進行分析。色譜條件為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，檢測波長284 nm，柱溫40℃，流動相為甲醇∶水(體積比 =10∶90)，流速0.8 ml/min，進樣量為 10 μL［8］。

1.7 5-HMF含量測定

1.7.1 5-HMF標準曲線

準確稱量0.14 g 5-HMF標準品定容至100 mL，依次稀釋為 2.8、11.2、22.4、44.8、89.6、179.2、358.4 mg/L的標準溶液在1.6部分所述色譜條件下進樣。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標做線性回歸方程y=82 114x－9 699.6，R2=0.998 9(n=7)，檢測方法在2.8～358.4 mg/L線性良好。

1.7.2 5-HMF含量測定

將1.3部分不同溫度不同加工時間取出的物料切碎、勻漿、離心后加入體積分數(shù)80%乙醇，靜置12 h后離心去沉淀，然后加入80%乙醇定容至100 mL，靜置2 h，吸取一定量上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾后打入進樣小瓶中用1.6部分所述色譜條件進行HPLC測定，同時以5-HMF標準品為外標。

2 結果與分析

2.1 黑蒜呈色物質的分離鑒定

根據1.4部分方法洗脫得到了21瓶洗脫液，其中第3瓶洗脫液呈現(xiàn)微黃色，第4瓶［其洗脫液是石V(油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=31∶31∶38］洗脫液揮發(fā)完后剩下的物質呈現(xiàn)較重的黑色，將其用一定量乙酸乙酯重溶后做ESI-MS鑒定，圖1顯示有3個明顯的離子峰，其質荷比分別是127、144、149，推測它們分別是 5-HMF(其 M=126)的 M+H+、M+Na+、M+NH4+峰，即圖1所代表的樣品應當為5-HMF的MS圖。

圖1 黑蒜呈色物質的質譜鑒定Fig.1 The mass spectrum identification of the color material of black garlic

為進一步確定該洗脫液中的呈色物質為5-HMF，采用1.6部分所述加標方法進行鑒定。圖2結果表明，瓶號4樣品在加入5-HMF標準品之前，“M”的峰強度約為400 mAU，而加入5-HMF標準品后，其保留時間與未加5-HMF時相同，且“M+HMF”峰的峰強度約為1150 mAU。綜合考慮該結果與圖1的MS結果，可以得出一個結論:即該洗脫液中呈色物質成分應為5-HMF。黑蒜成熟與否可以通過5-HMF含量來體現(xiàn)，因此，用HPLC測定.3個溫度條件下不同加工時期5-HMF的生成含量。

圖2 加5-HMF標準品之前和之后對比Fig.2 The comparison of results before and after adding 5-HMF

2.2 黑蒜加工過程中5-HMF的生成規(guī)律

2.2.1 5-HMF檢測方法的確定

圖3－a是5-HMF標準品HPLC圖譜，通過配制2.8～358.4 mg/L濃度的5-HMF標準品，用Excel作圖得到線性回歸方程y=82 114x－9 699.6。圖3－b是黑蒜提取物的 HPLC圖譜。由圖3－b可見，5-HMF在13.87 min出峰，且峰形對稱無干擾，可以滿足測定黑蒜中5-HMF的要求。

圖3 標準品和樣品中5-HMF的測定圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of 5-HMF standard and the sample

將圖3－b中對應5-HMF保留時間的峰面積帶入上述回歸方程中計算出5-HMF的含量，由圖4可知，(1)70、80、90℃ 3個溫度下加工成的黑蒜產品的5-HMF 含量分別為 4.79、31.28、154.87 μg/g，證明較高溫度會促進5-HMF生成。5-HMF是Maillard反應重要的中間產物，其不僅是Maillard反應和非酶褐變的重要指示因子，也是色素沉積的潛在條件［9］。在黑蒜熟化過程的“低溫熟化”階段，物料無5-HMF產生，表明新鮮大蒜本身無5-HMF，并且在45℃低溫熟化72 h也沒有5-HMF產生，此階段的生化反應主要是以大蒜中的水解酶類(如大蒜果聚糖水解酶［10］)為主的酶促反應，此階段的物料顏色由最初的白色逐漸呈現(xiàn)出微黃色。(2)在“高溫熟化”階段的反應主要為非酶褐變反應，5-HMF開始積累，同時物料的顏色開始由黃色迅速變成咖啡色，然后變成最終的黑色，此時得到了成熟黑蒜產品，并顯示出黑蒜的各種生理活性和功能特性。(3)3種溫度下的5-HMF含量均呈指數(shù)增長趨勢，用origin8.0軟件進一步對數(shù)據進行擬合，得到時間與5-HMF含量的函數(shù)關系見表1(P ＜0.05)。

圖4 5-HMF隨著溫度和時間的含量變化Fig.4 The variation in content of 5-HMF as the temperature and time

2.2.2 5-HMF生成反應動力學

將加工時間和5-HMF的函數(shù)關系用零級反應動力學模型和一級反應動力學模型進行擬合分析發(fā)現(xiàn)，其函數(shù)關系更符合一級反應動力學方程(表2)。而且C0=1.02 μg/g，速率常數(shù)的對數(shù)和溫度的關系符合方程ln K=－3 862.5(1/T)+7.98，其積分式為K=e7.98exp(－3 862.5/T)= 2.91×103 exp(－32.11/RT)，此方程符合阿雷尼烏斯公式。其中頻率因子Kf=2.91×103h－1，反應活化能Ea=32.11 kJ/mol。

表1 5-HMF生成的動力學方程Fig.1 Kinetics of the 5-HMF formation reaction in black garlic

圖5 5-HMF生成的阿雷尼烏斯曲線Fig.5 Arrhenius plots for 5-HMF accumulation

陳磊［11］證實黃酒中5-HMF的生成反應也屬于一級反應，與本實驗結果一致。此外，F(xiàn)allico［12］研究蜂蜜當中5-HMF的動力學反應時發(fā)現(xiàn)，不同種類蜂蜜中5-HMF的反應活化能在32.5～43.6 kJ/mol之間，而本實驗測得5-HMF的反應活化能為32.11 kJ/mol，由此可見，在不同的反應體系中，同一種物質的反應活化能會有所不同，陳磊在研究黃酒中5-HMF的生成動力學時證實弱極性物質會促進5-HMF生成。

3 討論

一般認為，低分子有色化合物和高分子的類黑精是發(fā)酵食品顯黑色的主要原因，5-HMF屬于低分子黑色化合物的一種，在真空硅膠柱純化收集到的21瓶洗脫液中，除第4瓶洗脫液(主要物質是5-HMF)之外，第20瓶洗脫液，即石油醚-乙酸乙酯-甲醇(體積比=31∶31∶38)洗脫液部分也呈黑色。第20瓶洗脫液的極性大于第4瓶洗脫液極性，因此推測此部分洗脫液有可能是大分子的類黑精。然而由于類黑精成分復雜，無法對其定性定量分析，而5-HMF是一種已知的物質，而且5-HMF的檢測方法已經建立，研究其生成規(guī)律相對容易，因此，5-HMF用來監(jiān)控黑蒜的品質更準確和方便。此外，本實驗以溫度為變量，pH等其他因素對黑蒜中5-HMF生成規(guī)律的影響有待進一步研究，不過Fallico等人以溫度和pH為變量證實5-HMF生成屬于偽一級反應，即當pH固定時，單一以溫度為變量，5-HMF的生成屬于一級反應。

目前關于5-HMF好壞的報道仍有較大的爭議［13－14］，因此，通過應用黑蒜加工過程中 5-HMF 含量和加工時間的動力學模型中的參數(shù)可以控制5-HMF的生成含量。

4 結論

本實驗分離鑒定出黑蒜中的主要呈色物質之一5-HMF，并通過不同溫度條件下的加工，測定不同時期物料的5-HMF含量，發(fā)現(xiàn)加工時間和5-HMF含量的函數(shù)關系符合一級反應動力學方程，應用于阿雷尼烏斯方程后得到其活化能為32.11 kJ/mol。利用這個動力學模型可以有效控制5-HMF的生成量。例如在黑蒜加工過程中，可以通過低溫延長熟化時間來減少5-HMF含量生成，此外，也可以利用該動力學模型可以對黑蒜成熟與否和黑蒜品質做出評判。

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