大杯蕈子實體多糖提取優(yōu)化及抗氧化活性分析

張 晨，趙法茂，胡春龍，劉正帥，劉貴芬，賈 曉

(1.山東農業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271000;2.泰山學院生物與釀酒工程學院，山東泰安 271021)

大杯蕈(Clitocybe maxima)在真菌分類學上，屬擔子菌綱(Basidiomycetes)、口蘑科(Tricholomataceae).大杯蕈營養(yǎng)豐富，蛋白質含量豐富，必需氨基酸的數量及組成比一般食用菌更接近模式蛋白.另還含有多種人體必需的礦物元素，如鋅、鉬、鈷等微量元素.經全國各地引種栽培，大杯蕈已實現規(guī)?；a，市場前景廣闊.近幾年來，食用菌多糖在人體醫(yī)療保健中的作用日益引起人們的關注.食藥用多糖的組成和結構主要有以下幾種類型:(1)葡聚糖，是食用菌多糖中的主要構成部分，其主鏈是由β-1，3糖苷鍵連接，支鏈由β-1，6糖苷鍵連接，如香菇多糖;(2)甘露聚糖，其主鏈是由α-1，4糖苷鍵連接，如靈芝多糖;(3)雜多糖;(4)糖蛋白和多糖肽等［1-2］.

食用菌多糖是能夠控制細胞分裂分化，調節(jié)細胞生長衰老的一類活性多糖，主要由幾丁質和β-(1，3)-D-葡聚糖構成，它主要是從擔子菌與子囊菌子實體、菌絲體和發(fā)酵液中分離出的具有生物活性的天然高分子多聚物.藥理實驗表明，食用菌多糖具有調節(jié)人體機能、提高免疫力、增強骨髓造血功能及抗輻射、抗癌、抗病毒、抗腫瘤、延緩衰老、降血脂、促進兒童生長發(fā)育等生理功能［3］;還可通過非特異性途徑，提高機體對抗原或微生物病原體的特異性反應［4］，因而被稱為“生物應答調節(jié)劑”.目前國內外對大杯蕈研究主要集中在探討其生物學特性、化學組成成分、營養(yǎng)價值及高產栽培技術等，但對其含有的生物活性成分尤其是多糖的研究比較缺乏［5-6］.本實驗擬利用Plackett-Burmn實驗(PB實驗)和響應面分析法(Response surface methodology，RSM)優(yōu)化大杯蕈子實體多糖(Fruting body polysaccharide，FPS)的分離提取條件，并對其體外抗氧化活性作初步分析，旨在為大杯蕈子實體多糖提取工藝的優(yōu)化及構效關系的深入研究提供理論基礎.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大杯蕈(Clitocybe maxima)子實體，由山東農業(yè)大學微生物實驗室提供.

1.2 實驗方法

1.2.1 大杯蕈子實體多糖PB實驗

(1)大杯蕈子實體多糖的提取

大杯蕈烘干后于粉碎機中粉碎成粉末，-4℃冰箱保存?zhèn)溆?使用DX8Trial軟件繪制大杯蕈子實體多糖PB實驗表格(表1)，采用9因素3水平的方案，各因素對應項目如表1.分別稱取0.5 g大杯蕈子實體粉末放入編號為1～17的離心管中.按照表1所示實驗項目進行實驗，得到17組大杯蕈多糖提取物.向17只離心管中加入20 ml水，70℃左右水浴，直至溶解.3600×g離心15 min.取1ml上清液置于試管中，稀釋10倍，分別取1 ml稀釋液設置三組平行試驗.分別向每支平行試管中加入1 ml去離子水，1 ml新配苯酚溶液，5ml濃硫酸.反應20 min，于490nm下測定OD值.

表1 大杯蕈子實體多糖的PB試驗因素水平及編碼

(2)大杯蕈多糖含量測定:苯酚—硫酸法［7］

苯酚-硫酸法是利用高濃度的硫酸可以在短時間內將多糖水解成寡糖和單糖，或者多糖經脫水生成糠醛或其衍生物，苯酚類試劑可與游離的單糖、寡糖、糖醛酸或甲苯衍生物起顯色反應，已糖在490 nm處，戊糖及糖醛酸在480 nm處有最大光吸收，且吸光值與糖含量成正比.

6%苯酚溶液配制:

熱水浴條件下，量取6 mL苯酚溶于10 mL容量瓶中，用去離子水定容，搖勻后，即得到約為6%的苯酚溶液.置于棕色瓶中備用(現配現用).

標準曲線制作:

準確稱取105℃下干燥的標準葡萄糖0.1 g，加去離子水定容至100 mL，取10 mL，再定容到100 mL，即得100 μg/mL 的標準葡萄糖溶液.精確量取葡萄糖標準溶液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別加去離子水至2 mL，以2 mL去離子水作為空白對照，分別加入1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，靜置10 min，充分搖勻后室溫放置20 min，于490 nm下測OD值，以OD值對葡萄糖含量回歸，得回歸曲線(圖1).

式中:C—從標準曲線上查得樣品測定管中葡萄糖質量(mg);

V1—樣品提取時定容體積(mL);

V2—樣品比色管中取樣液體積(mL);

m—樣品稱量質量(mg).

圖1 葡萄糖標準曲線

1.2.2 大杯蕈子實體多糖響應面優(yōu)化

根據上述PB實驗的結果，使用Design-Expert對數據進行回歸分析.選擇對多糖提取量影響顯著的pH，提取溫度，提取次數繼續(xù)進行下一步實驗(表2).分別稱取0.5 g大杯蕈子實體粉末放入編號為1～17的離心管中.按照表2所示實驗項目進行實驗，得到17組大杯蕈多糖提取物.向17只離心管中加入20 mL水，70℃左右水浴，直至溶解，3600×g離心15 min.取1 mL上清液置于試管中，稀釋10倍，再取1 ml稀釋液設置三組平行試驗，分別向每支平行試管中加入1 mL去離子水，1 mL新配苯酚溶液，5 mL濃硫酸，反應20 min后于490nm下測定OD值.

表2 大杯蕈子實體多糖的響應面試驗因素水平及編碼

1.2.3 大杯蕈多糖體外抗氧化能力測定

(1)還原力測定——普魯士藍法［8］

取1 mL樣品，加入2.5 mL 0.2 mol/L的pH 6.6的磷酸緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀，混合后50℃恒溫水浴20 min.用流水冷卻后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸充分混合，3000×g離心15 min.取2.5 mL上清液加入2.5 mL去離子水和2.5 mL 0.1%的三氯化鐵，靜置10 min.用去離子水作為對照，于700 nm波長下測定OD值.

(2)清除羥基自由基—鄰二氮菲-Fe2+氧化法［9］

取1 mL樣品，加入4 mL 0.2 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液，1 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵和1.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲，立即混勻，再加入1 mL H2O2后37℃保溫1 h.以去離子水代替H2O2作為空白對照，于536 nm下測定OD值.

其中:EC50代表產生50%清除率所需的樣品濃度(mg/L).

A:樣品+H2O2;

Ai:無樣品無H2O2;

Aj:無樣品有H2O2.

(3)清除超氧陰離子自由基［10］

取1 mL樣品加入4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl和3.2 mL去離子水，25℃下保溫20 min，再加入0.3 mL鄰苯三酚(經過25℃水浴保溫20 min)，反應3min后，加入1 mL 5%VC終止反應，于420 nm下的測定OD值.

其中:A0:去離子水;

A:樣品.

(4)清除2，2—二苯代苦味肼(DPPH)自由基［11］

取2mL樣品加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液，混合均勻，30 min后在波長517 nm下測定OD值Ai.同法測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液與2 mL去離子水混合后的OD值Ac，以及2 mL樣品與2 mL去離子水混合后的OD值Aj.

2 結果與分析

2.1 大杯蕈子實體多糖的提取優(yōu)化

2.1.1 PB 實驗

通過軟件Design Expert對實驗結果進行分析，大杯蕈子實體多糖的PB試驗結果見表3，PB試驗的ANOVA分析(方差分析)見表4.結果表明，該模型的回歸性良好.通過P值分析，影響大杯蕈子實體多糖提取量的顯著因素是醇沉時間，乙醇倍數和提取次數，其余為不顯著或者是可忽略因素.

表3 大杯蕈子實體多糖的PB實驗結果

表4 大杯蕈子實體多糖PB實驗得率ANOVA分析

2.1.2 響應面法

在響應面實驗中，利用軟件Design Expert對pH，提取溫度和提取次數三個因素進行優(yōu)化，響應面實驗設計見表5.ANOVA分析顯示模型顯著，失擬值不顯著，說明模型和現實的擬合程度較好(表6).

對于大杯蕈子實體多糖的PB試驗所得的三個主要影響因素乙醇倍數、醇沉時間和提取次數，通過計算機輔助軟件Design Expert進行設計，通過模型分析得到回歸方程:

方差分析顯示，該模型的P-value值小于0.05，為顯著水平;Lack of Fit不顯著，說明該模型能很好地說明多糖的實際產量.

通過實驗分析可得，大杯蕈子實體多糖提取的最佳條件是乙醇倍數3.55，醇沉時間28.77 h，提取次數2.57次，在此條件下，大杯蕈子實體多糖的理論得率是2.549%.

表5 大杯蕈子實體多糖響應面實驗設計

表6 大杯蕈子實體多糖RSM實驗得率ANOVA分析

大杯蕈子實體多糖的得率與各因素的關系如下圖(圖2、圖3、圖4)所示:

圖2 大杯蕈子實體多糖得率與醇沉時間和乙醇倍數的關系

圖3 大杯蕈子實體多糖得率與提取次數和乙醇倍數的關系

圖4 大杯蕈子實體多糖得率與提取次數和醇沉時間的關系

2.2 大杯蕈子實體多糖體外抗氧化活性分析

2.2.1 大杯蕈子實體多糖還原力測定

還原力是表示抗氧化物質提供電子能力的重要指標，抗氧化物質通過提供電子可使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性.研究證實抗氧化活性同還原力是密切相關的，大杯蕈子實體多糖于700 nm下比色，以吸光值表示還原力的大小，吸光值越大，表明樣品抗氧化能力越好，還原力越強.

大杯蕈子實體多糖的還原能力見圖5.由圖5可知，其還原能力隨著濃度的增加呈上升趨勢.在濃度1000～1500 μg/mL之間，OD值增長幅度很小;當濃度達到1500 μg/mL后，OD值呈直線增長;在5000 μg/mL時，大杯蕈子實體多糖的OD值為0.629.

圖5 大杯蕈子實體多糖的還原力測試

2.2.2 對羥基自由基的清除能力

從圖6中可以看出，隨著大杯蕈子實體多糖的濃度的增加，對羥基自由基的清除能力呈上升趨勢，在濃度為2000～2500 μg/mL區(qū)間時清除率增長較快;當濃度達到3500 μg/mL后，清除率增長較為平穩(wěn);當濃度為5000 μg/mL時，樣品對于羥基自由基的清除率為27.19%.根據圖線走勢分析，其EC50約等于9500μg/mL.

2.2.3 對超氧陰離子自由基的清除能力

對于超氧陰離子自由基的清除能力如圖7所示，從圖7可以看出，隨著樣品濃度的增加，其對超氧陰離子自由基的清除率呈現上升趨勢.在濃度為1500～2000 ug/mL之間時，大杯蕈子實體多糖對超氧陰離子自由基的清除率增長較為迅速;在濃度為5000 ug/mL時，大杯蕈FPS對于超氧陰離子自由基的清除率為60.101%.通過對圖7分析，大杯蕈子實體多糖的EC50約等于3800 ug/mL.

圖6 大杯蕈子實體多糖對羥基自由基的清除作用

圖7 大杯蕈子實體多糖對超氧陰離子的清除作用

2.2.4 對DPPH的清除作用

DPPH是二苯代苦味肼自由基，有清除劑存在時，其在最大光吸收波長處的吸光值下降，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，以此可以鑒定試驗樣品的抗氧化能力.從圖8可以看出，當濃度在1000～1500 ug/mL之間時，對DPPH清除率增長緩慢;當濃度達到1500 ug/mL以上時，清除率呈線性增長;在濃度為5000 ug/mL時，大杯蕈對于DPPH的清除率為69.7%.EC50約等于2600 ug/mL.總之，隨著樣品濃度的增加，大杯蕈子實體多糖對DPPH的清除率逐漸增大.

3 討論

影響大杯蕈多糖提取量多少的因素有很多，包括加水倍數、水浴pH、提取溫度、提取次數、提取時間、乙醇體積、乙醇濃度、醇沉時間、醇沉溫度等.不同蕈菌影響其子實體多糖提取的顯著因素有所不同，影響大杯蕈子實體多糖提取量的顯著因素是醇沉時間，乙醇倍數和提取次數;有研究發(fā)現影響香菇子實體多糖提取的顯著因素是pH值、提取次數、提取溫度［12］.本實驗采用PB實驗和響應面法進行優(yōu)化，得到了大杯蕈多糖的最佳提取條件，為大杯蕈多糖的后續(xù)相關研究提供了基礎數據.

自由基學說是Denham Harman在1956年提出的，認為機體在生命代謝過程中產生的一些自由基對生命有機體有害，生物體的衰老過程就是自由基不斷積累的結果.自由基可以誘發(fā)腫瘤形成，這是自由基導致DNA損傷而造成基因突變引起的.此外，自由基可以氧化細胞中的多種物質，使生物膜受到損傷;還能夠使蛋白質、核酸等大分子交聯，影響其正常功能［13］.因此，自由基生物學研究越來越受到人們的重視.雖然，生物體內存在酶和非酶自由基清除系統(tǒng)，但開發(fā)和尋找外源性自由基清除劑對預防衰老和治療疾病具有顯著醫(yī)學意義.本研究證明，大杯蕈子實體多糖具有潛在的體外抗氧化活性，這一研究結果對深入認識和開發(fā)真菌多糖類藥物具有一定的參考價值.

圖8 大杯蕈子實體多糖對DPPH的清除作用

4 結論

通過大杯蕈子實體多糖的PB實驗和響應面實驗，優(yōu)化了其分離提取條件.通過回歸曲線得到多糖的最佳提取條件是乙醇倍數3.55，醇沉時間28.77 h，提取次數2.57次，在此條件下，大杯蕈子實體多糖的理論得率是2.549%.考慮到操作的方便性，將最佳提取條件調整為乙醇倍數3.6，醇沉時間29 h，提取次數3.00，在此條件下，大杯蕈子實體多糖的理論得率是2.329%，實際值為2.015%.

本實驗測定了大杯蕈子實體多糖的還原能力以及其對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH的清除能力.當濃度為5000 μg/mL時，大杯蕈子實體多糖的還原力為0.629;樣品對于羥基自由基的清除率為27.19%，其EC50約等于9500 μg/mL;對于超氧陰離子自由基的清除率為60.101%，EC50約等于3800 ug/mL;對于DPPH的清除率為69.7%，EC50約等于2600 ug/mL.隨著樣品濃度的增加，大杯蕈子實體多糖還原力逐漸增強，對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH的清除率也逐漸增大.

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