桃紅四物湯對肝纖維化大鼠肝組織星狀細胞增殖的影響

羅利瓊，陳東波

(1.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院;2.廣東藥學院基礎(chǔ)學院，廣東 廣州 510006)

肝纖維化不是一個獨立的疾病，而是各種慢性肝病的共同病理學基礎(chǔ)，許多慢性肝臟疾病均可引起，也是慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)階段。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明合理治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進程，從而緩減甚至治愈肝纖維化［1］。肝星狀細胞 (hepatic stellate cell，HSC)的激活和增生被認為是肝纖維化發(fā)生、進展的中心環(huán)節(jié)。通過促進HSC凋亡并抑制其增殖來發(fā)揮抗肝纖維化作用已成為目前研究的熱點。中藥及其復(fù)方具有多成分、多環(huán)節(jié)與多途徑的作用特點，以其獨特的療效，在抗纖維化的研究中占有日益重要的地位［2，3］。中醫(yī)研究證實，活血化瘀為治療肝纖維化的基本治法，在此基礎(chǔ)上注重病證結(jié)合，進行綜合治療，可有效抑制肝纖維化發(fā)展［4］。本文以桃紅四物湯為研究對象，從影響HSC活化等方面進行研究，以期驗證該方抗肝纖維化功效，深入探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar雄性大鼠40只，體重200±20g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品制備 桃紅四物湯由熟地、白芍、當歸、桃仁、川芎、紅花按4:3:3:3:2:2比例粉碎混合，按傳統(tǒng)方法煎煮過濾，于恒溫水浴鍋中濃縮制成每毫升含生藥1.0g。

1.1.3 試劑 分析純CCl4購自蘇州百與化工有限公司;HE、Masson染液由上海虹橋樂翔醫(yī)用試劑有限公司提供;血清 GPT、GOT、ALB、TP、Bil試劑盒為上海申索佑福醫(yī)學診斷用品有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 半自動生化分析儀 (康泰醫(yī)學系統(tǒng)有限公司，型號:BC300);顯微鏡 (日本奧林巴斯公司，型號:ix71);流式細胞分析儀 (美國貝克曼庫爾特公司，型號:FC500)。

1.2 方法

1.2.1 給藥 取Wistar雄性大鼠分為4組，每組10只:對照組，模型組，桃紅四物湯低、高劑量組。正常組除外，其它各組大鼠首次皮下注射純CCl45mL/kg，以后皮下注射含20%CCl4的花生油3mL/kg，2次/周，連續(xù)12周。第7周起，低、高劑量桃紅四物湯組灌胃相應(yīng)劑量桃紅四物湯水溶液，1次/天。

1.2.2 血清指標檢測 末次給藥并禁食16h，觀察各組大鼠癥狀并稱體重，以3%戊巴比妥麻醉大鼠后頸總動脈取血，離心 (3000r/min，15min)分離血清，放置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩栏癜丛噭┖姓f明書中操作方法檢測肝功能生化指標GPT、GOT、ALB、TP 及 Bil。

1.2.3 病理學觀察 迅速剖取各組大鼠肝臟相同部位組織，約0.5cm3，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色觀察肝臟組織病理改變。

1.2.4 HSC增殖及凋亡檢測 迅速剖取各組大鼠部分肝臟組織，生理鹽水清洗，剪碎組織，經(jīng)尼龍網(wǎng) (200目)濾過制備細胞懸液，分選HSC，于檸檬酸緩沖液中放置1h，將細胞濃度調(diào)整至約1×106/ml，離心，去上清，加入A溶液 (胰酶消化液)1.8ml，充分作用后加入1.5ml B溶液 (胰酶抑制液)10min，加入1.5ml C溶液 (PI，碘化丙啶)作用15min;再次濾過尼龍網(wǎng) (200目)，行流式細胞檢測。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài) 正常組大鼠動作靈敏，毛發(fā)光澤順滑，食量及大便正常，體重明顯增加。模型組大鼠現(xiàn)萎靡、嗜臥狀，活動減少，毛色蓬松干枯，飲食減少，體態(tài)消瘦，體重明顯減輕。桃紅四物湯低、高劑量組大鼠上述表現(xiàn)較模型組有不同程度減輕。

2.2 血清指標 與正常組比較，模型組大鼠血清GPT、GOT、Bil水平明顯升高 (P＜0.01)，TP、ALB水平明顯降低 (P＜0.05)。與模型組比較，低、高劑量桃紅四物湯組血清GPT、GOT、Bil水平明顯降低 (P＜0.05或P＜0.01)，高劑量桃紅四物湯組血清 TP、ALB水平明顯升高 (P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清肝功能指標水平 (，n=10)

表1 各組大鼠血清肝功能指標水平 (，n=10)

注:與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01。下表同。劑量 (g/kg/d)按生藥計。

2.3 病理結(jié)果 HE染色顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞索呈放射狀整齊排列，肝竇正常，未見膠原纖維增生及炎性細胞浸潤。肝纖維化模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細胞索排列紊亂，部分肝細胞腫脹，脂肪變性壞死，組織壞死、團塊再生和炎性細胞浸潤明顯，匯管區(qū)可見大量纖維細胞、成纖維細胞和膠原纖維。與模型組比較，低、高劑量桃紅四物湯組大鼠上述表現(xiàn)有不同程度改善。

2.4 HSC增殖及凋亡 與模型組比較，桃紅四物湯組大鼠HSC凋亡率明顯提高 (P＜0.05或P＜0.01)，HSC處于G0/G1期細胞比例明顯增多 (P＜0.05或 P＜0.01)。見表2。。

表2 桃紅四物湯對HSC凋亡率和細胞周期的影響 (，n=10)

表2 桃紅四物湯對HSC凋亡率和細胞周期的影響 (，n=10)

3 討論

肝臟遭到各種致病因子侵襲時，引起肝臟損害與炎癥反應(yīng)，激活肝組織免疫系統(tǒng)而進行組織修復(fù)。肝纖維化是指這種組織修復(fù)過程過度及失控時，肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導致肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程。CCl4誘導大鼠肝損傷模型是研究肝損害和肝纖維化的經(jīng)典方法。其機制為CCl4經(jīng)肝細胞微粒體內(nèi)細胞色素P450代謝裂解成的三氯甲基自由基而致脂質(zhì)過氧化，并介導肝細胞損傷，如肝細胞脂肪病變及壞死，從而激活貯脂細胞，導致膠原分泌增加，形成肝纖維化［5］。

肝纖維化形成過程中，脂質(zhì)過氧化使肝細胞膜受損，導致肝細胞內(nèi)ALT、AST等酶外漏，血清ALT和AST活性增高［6］。血清總蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)為反映肝細胞合成代謝功能的指標，肝功能受損時，二者在血液中濃度隨之降低，其降低程度與肝功能損害程度呈正相關(guān)。肝損傷后，因膽紅素代謝和排泄障礙導致血清Bil水平增高。因此，血清ALT、AST、Bil、TP、ALB水平為反映肝功能受損程度的指標。

HSC位于肝竇內(nèi)皮細胞與肝細胞之間的竇周間隙內(nèi)，為肝臟的一種非實質(zhì)細胞。正常情況下，HSC處于靜止狀態(tài)，具有儲存維生素A和脂肪，合成和分泌蛋白多糖、膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其組織抑制劑 (TIMP)的功能。肝損害 (病毒、化學物質(zhì)、機械損傷等因素)時，在肝細胞壞死及炎癥刺激下，肝臟內(nèi)細胞因子 (包括HSC自分泌和旁分泌的細胞因子)通過各種傳導通路激活HSC，使其大量增殖、遷移，并分泌大量的細胞外基質(zhì) (ECM)沉積于肝臟，活化的HSC使其增生轉(zhuǎn)化為肌樣成纖維細胞，從而啟動并維持肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，抑制HSC的增殖或誘導活化的HSC凋亡都可顯著減少ECM沉積從而減輕纖維化程度［7］。

本研究結(jié)果顯示，桃紅四物湯可使肝纖維化模型大鼠血清GPT、GOT、Bil水平明顯降低，而血清TP、ALB水平明顯升高;能有效增加HSC的凋亡，并使HSC處于G0/G1期細胞比例明顯增多而降低HSC增殖率。提示桃紅四物湯可改善肝纖維化大鼠基礎(chǔ)生化指標，減輕病理程度，其作用機制可能與促進HSC凋亡并抑制HSC的增殖有關(guān)。

［1］謝晶日，那坤，李明，等.中醫(yī)藥治療肝纖維化臨床研究進展［J］.中國中醫(yī)急癥，2009，18(3):433－435

［2］李小紅，葉軍.中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療肝硬化研究進展［J］.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2011，25(12):49－51

［3］洪朝金.肝纖維化病機治法研究概況 ［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2007，25(2):330－331

［4］劉燕玲，李志更，郭朋，等.以活血化瘀法為核心治療肝纖維化的思路 ［J］.中醫(yī)雜志，2009，50(1):76－79

［5］趙玉瑤，劉方洲，楊小平，等.臌脹片抗大鼠肝纖維化作用的實驗研究 ［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23(12):922－925

［6］童英，閆向東，高珊，等.四氯化碳急性肝損傷敏感指標的研究［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2000，12(6):10－13

［7］K Breitkop，f B Lahme，CG Tag，et al.Expression andmatrix deposition of latent transforming growth factor beta binding proteins in normal and fibrotic rat liver and transdifferentiating hepatic stellate cells in culture［J］.Hepatology，2001，33(3):387－396