TBA-Pb2+-hemin模擬酶催化顯色法測定水中痕量鉛

劉珊渡，楊雪蔚，周武雄，王永生

(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽 421001)

鉛是一種環(huán)境中普遍存在的重金屬污染物，有蓄積毒性，能造成人體多器官、多系統(tǒng)的損害［1］。因此，環(huán)境中鉛的檢測尤為重要。目前，鉛的檢測方法主要有原子吸收法［2］、分光光度法［3］、電化學(xué)方法［4］等。但要實(shí)現(xiàn)快速、低成本、穩(wěn)定、靈敏的檢測，仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。

近年來，適體由于其特異性和穩(wěn)定性好而被廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。凝血酶適體(TBA)(序列為 5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3')［5］，能特異性地結(jié)合 Pb2+，形成 G-四聚體結(jié)構(gòu)［6］。

本文基于該G-四聚體與氯化血紅素(hemin)結(jié)合后，形成辣根過氧化物模擬酶［7］，可催化H2O2氧化 2，2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，生成藍(lán)綠色自由基產(chǎn)物，導(dǎo)致體系在416 nm處的吸光度增加的原理，建立測定Pb2+的比色新方法，并應(yīng)用于環(huán)境水樣測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸鉛、Tris-HCl緩沖液等均為分析純;TBA，色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為滅菌二次蒸餾水。

UV2550型紫外-可見分光光度計(jì);AB204-S型電子分析天平;HH-W21-600型電熱恒溫水浴箱;PB-21精密酸度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于1.5 mL EP 中，依次加入 0.1 mol/L pH 7.4的 Tris-HCl緩沖液 200 μL，1.0 × 10－6mol/L TBA溶液50 μL，1.0 ×10－7mol/L 鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，室溫反應(yīng)40 min。加入2.0×10－5mol/L hemin溶液50 μL，放置 60 min。加入 5.0 × 10－3mol/L ABTS溶液 50 μL 和 1.2 ×10－2mol/L H2O2溶液 50 μL，用蒸餾水稀釋至500 μL，避光放置10 min。在紫外-可見分光光度計(jì)上200～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到吸收光譜。取最大吸收波長415 nm處的吸光度值A(chǔ)和試劑空白A0，得到△A=A－A0。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

由圖1可知，TBA-hemin-ABTS-H2O2體系在415 nm處的吸光度值很低，加入Pb2+后，體系在415 nm的吸光度增強(qiáng)(圖1A)?？赡艿睦碛墒牵琍b2+能夠促進(jìn)富G序列的凝血酶適體(TBA)生成G-四聚體結(jié)構(gòu)，G-四聚體和氯化血紅素復(fù)合物具有過氧化物模擬酶活性，能夠催化H2O2氧化2，2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，生成藍(lán)綠色自由基產(chǎn)物，導(dǎo)致體系在416 nm處的吸光度增加。隨著體系Pb2+濃度的增加，體系的吸光度值相應(yīng)增加，并在一定范圍內(nèi)與Pb2+濃度具有良好的線性關(guān)系(圖1B)。據(jù)此，建立了DNA模擬酶催化顯色法測定Pb2+的新方法。

圖1 Pb2+測定體系吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of Pb2+systemA:cPb2+=2.0 ×10－9mol/L，cTBA=1.0 ×10－7mol/L;B:cPb2+:(1 ～7)/(×10－9mol/L)=0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖體系的選擇 實(shí)驗(yàn)了 Tris-HCl、Tris-CH3COOH和HEPES三種緩沖液對體系的影響。結(jié)果表明，體系在Tris-HCl緩沖溶液中△A最大，線性關(guān)系最好;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)不同pH的影響，結(jié)果表明，pH 在6.8～7.4之間△A 逐漸增大，7.4 ～7.6 之間△A較大且穩(wěn)定，7.6～8.0之間△A逐漸減小，因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液。

2.2.2 TBA用量的選擇 研究了TBA濃度對于體系的影響，結(jié)果表明，TBA 濃度在 0.2×10－7～1.0×10－7mol/L逐漸升高，當(dāng)濃度 達(dá)到 1.0 ×10－7mol/L時(shí)趨于穩(wěn)定。因此，體系TBA濃度選擇1.0 ×10－7mol/L。

2.2.3 Hemin用量的選擇 研究了hemin的用量對反應(yīng)體系的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hemin用量在10～40 μL 范圍內(nèi)，ΔA 逐漸增大，40～60 μL 范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定，＞60 μL后，ΔA逐漸減小。所以實(shí)驗(yàn)選擇2.0 ×10－5mol/L hemin 用量為50 μL。

2.2.4 c(ABTS):c(H2O2)的選擇 結(jié)果顯示，當(dāng)c(ABTS)∶c(H2O2)為1∶2.4時(shí)，ΔA最大且基本恒定，而當(dāng)ABTS的量過多或過少時(shí)，ΔA均減小。故實(shí)驗(yàn)選擇 c(ABTS):c(H2O2)=1∶2.4。

2.2.5 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響 實(shí)驗(yàn)了20～100℃以及10～100 min內(nèi)，反應(yīng)體系吸光度的變化，結(jié)果表明，選擇20～25℃下，反應(yīng)40～60 min時(shí)，體系ΔA最大且基本穩(wěn)定。

2.2.6 試劑加入順序的影響 在以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)計(jì)不同試劑加入順序，分別測定其吸光度變化值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以Tris-HCl→TBA→Pb2+→ Hemin→ABTS→H2O2→H2O的加入順序所得體系的△A最大。

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與精密度 按以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，分別測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，線性范圍為 1.07 ×10－10～6.01 ×10－7mol/L，線性回歸方程為 ΔA=0.409c(×10－9mol/L)+40.7，相關(guān)系數(shù) r=0.996 6;對 Pb2+為1.5 ×10－8，6.0 ×10－8，1.5 ×10－7mol/L 的 3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行7次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%，1.25%和 3.45%;經(jīng) 11 次空白平行測定，按照 CL=3Sb/k公式計(jì)算，檢出限為 3.21×10－11mol/L。

2.3 共存物質(zhì)的影響

根據(jù)可能共存的實(shí)際情況，考察了多種干擾物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)相對誤差控制在±5% 以內(nèi)時(shí):500 倍量的 Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Ni+、Co2+、Cr3+、Cd2+、Cl－、NO3－;10 倍量的 Na+、Hg+、K+均不干擾測定。

2.4 樣品分析

采集了2份分別來自湘江不同水域的水樣。按本實(shí)驗(yàn)方法對每份樣品做6次平行測定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 環(huán)境水樣測定結(jié)果(n=6)Table 1 The determination results of Pb2+in environmental water samples

3 結(jié)論

在pH 7.5 Tris-HCl緩沖溶液中，以TBA為識別元件，ABTS為顯色劑，建立了基于過氧化物模擬酶的鉛離子比色檢測新方法。方法線性范圍為1.07×10－10～ 6.01 × 10－7mol/L，檢出 限 為 3.21 ×10－11mol/L，方法靈敏度高、特異性好，結(jié)果滿意。

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