星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化乳化交聯(lián)法制備恩諾沙星殼聚糖微球

于海峰，王洪光，徐元廠，王璐

(青島科技大學(xué)藥學(xué)系，山東青島 266042)

恩諾沙星(Enrofloxacin)，又名乙基環(huán)丙沙星，屬于氟奎諾酮類化學(xué)合成抑菌劑，具有殺菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛、與其他藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn)［1］。由于恩諾沙星半衰期較短，臨床多采用多劑量給藥［2］。本文嘗試制備恩諾沙星緩釋微球，并對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

囊材選用的殼聚糖是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)(chitin)經(jīng)脫乙酰作用得到的，殼聚糖獨(dú)特的化學(xué)和生物特性使其成為一種有吸引力的生物材料，并且在日常生活中被廣泛應(yīng)用，如處理廢水、酶的固定化［3］、手術(shù)和藥物傳遞系統(tǒng)［4］等。在這些應(yīng)用中，殼聚糖最重要的屬性是其生物相容性。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法是最近幾年藥學(xué)工作者常用的集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法［5］。其特點(diǎn)是各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)與中心點(diǎn)的距離相等，采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合的方法，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)精度，預(yù)測值較正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)更加接近真實(shí)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

恩諾沙星(浙江新昌國邦獸藥廠，含量99.5%);殼聚糖(脫乙酰度 80.0% ～95.0%);液體石蠟、Span-80均為化學(xué)純;磷酸，色譜純;冰乙酸、戊二醛(50%)均為分析純。

U3000型高效液相色譜儀;IT-09A5型恒溫磁力攪拌器;XSP-2CA型光學(xué)顯微鏡;KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

精密稱取處方量恩諾沙星，加至3%乙酸中，超聲溶解，加入殼聚糖溶解，配成殼聚糖-恩諾沙星乙酸溶液。加入Tween-80，靜置，去氣泡成水相。將5 mL Span-80加入液體石蠟中，攪拌均勻成油相。邊攪拌(攪拌速度900 r/min)邊通過注射器將水相緩慢滴加入油相，制備成W/O型乳劑，乳化2 h后，滴加交聯(lián)劑1 mL 25%戊二醛固化，固化一定時(shí)間后，靜置，傾去油相，沉淀經(jīng)石油醚洗滌，無水乙醇脫水，40℃真空干燥，得載藥殼聚糖微球。

1.3 分析測試

1.3.1 色譜條件 色譜柱為 C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流動(dòng)相為磷酸(用三乙胺調(diào)至pH 3)-乙腈(70∶30);流速 1 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長 280 nm;進(jìn)樣量 20 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取恩諾沙星30 mg，置100 mL量瓶中，加入5%乙酸5 mL，充分溶解，加稀磷酸定容。分別精密量取溶液1，2，3，4，5，6，7 mL，于 50 mL 容量瓶中，加稀磷酸定容，得到濃度為6，12，18，24，30，36，42 μg/mL 的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后，取濾液進(jìn)樣測定。以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X，μg)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=16.700X+4.585 7，R2=0.999 4。結(jié)果表明，恩諾沙星在6～42 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3 載藥量、包封率測定 將恩諾沙星殼聚糖微球100 mg置0.1 mol/L鹽酸10 mL中超聲10 min。37℃放置24 h，充分研磨，離心(3 000 r/min)10 min，精密吸取上清液1 mL，用0.1 mol/L NaOH中和后，用蒸餾水稀釋定容至25 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾［6］。高效液相色譜進(jìn)樣，測定峰面積并計(jì)算包封率、載藥量。

載藥量=(微球中包含的藥量/微球的質(zhì)量)×100%

1.3.4 微球的粒徑及形態(tài) 取微球置于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡400倍放大觀察其形態(tài)。照中國藥典2010版第二部附錄IX E粒度測定法第一法測定，計(jì)算平均粒徑。

1.3.5 微球體外釋放實(shí)驗(yàn) 精密稱取一定量的載藥微球，置于裝有pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL的透析袋中，置于具塞試劑瓶中，以PBS 100 mL為溶出介質(zhì)，溫度(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速100 r/min。分別于0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，6，8，12，18，24 h 取樣5 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量介質(zhì)。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，測定吸收峰，并計(jì)算藥物濃度和累計(jì)釋放率。

2 結(jié)果與討論

2.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對恩諾沙星微球制備影響較大的3個(gè)因素作為考察對象。即油水相比、殼聚糖濃度、交聯(lián)時(shí)間。根據(jù)CCD原理，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平。各因素取值區(qū)間端點(diǎn)水平根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而定。星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels for central composition design test

以包封率、載藥量、平均粒徑為評價(jià)指標(biāo)。由于因變量較多，對某一因變量有利的條件可能對其他因變量不利，各效應(yīng)間須達(dá)成妥協(xié)，使所有指標(biāo)綜合為一個(gè)值，可反映總體效應(yīng)結(jié)果，這種方法為“歸一化”法［7］。根據(jù)每個(gè)指標(biāo)優(yōu)選的條件，將每個(gè)因變量均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的歸一值，各指標(biāo)歸一值求算幾何平均數(shù)，得總評歸一值OD=(d1d2…dn)1/n，n為指標(biāo)數(shù)。對取值越小越好的因素(粒徑)和取值越大越好的因素(包封率、載藥量)采用Hassan方法［8］分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求歸一值 dmin和 dmax，dmin=(ymax－yi)/(ymax－ymin)，dmax=(yi－ymin)/(ymaxymin)。再以O(shè)D值為因變量，將各因素對OD值進(jìn)行多元非線性回歸擬合，數(shù)學(xué)模型方程為:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X12+b5X22+b6X32+b7X1X2+b8X1X3+b9X2X3，星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 2 Results of experiment designed by CCD

以平均粒徑(Y1)、包封率(Y2)、載藥量(Y3)、OD值為因變量，分別對各因素(自變量)用Statistica 10.0軟件進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，對于二項(xiàng)式方程，根據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對各系數(shù)進(jìn)行的t檢驗(yàn)結(jié)果，刪除P＞0.05的項(xiàng)后，再進(jìn)行二項(xiàng)式方程擬合，達(dá)到模型簡化的目的。結(jié)果如下:

2.2 效應(yīng)面法優(yōu)化

OD值隨因素變化的三維效應(yīng)面圖和二維等高圖見圖1～圖6。

圖1 綜合評分值(OD)對X1和X2的三維效應(yīng)面Fig.1 Three-dimensional response surface of OD with two factors

圖2 綜合評分值(OD)對X1和X2的二維等高圖Fig.2 Contour plot of OD with two factors

圖3 綜合評分值(OD)對X1和X3的三維效應(yīng)面Fig.3 Three-dimensional response surface of OD with two factors

圖4 綜合評分值(OD)對X1和X3的二維等高圖Fig.4 Contour plot of OD with two factors

圖5 綜合評分值(OD)對X2和X3的三維效應(yīng)面Fig.5 Three-dimensional response surface of OD with two factors

圖6 綜合評分值(OD)對X2和X3的二維等高圖Fig.6 Contour plot of OD with two factors

由圖可知，恩諾沙星殼聚糖微球制備的最佳工藝條件為:油水相比4.2，殼聚糖濃度2%，交聯(lián)時(shí)間3.5 h。

2.3 最優(yōu)條件驗(yàn)證

按照最佳工藝條件制備3批樣品，測定其平均粒徑、包封率、載藥量，并與預(yù)測值進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

表3 預(yù)測值與實(shí)測值的比較(n=3)Table 3 The comparison of predictive value and measured value

由表3可知，實(shí)測值與預(yù)測值能夠較好的吻合，二者偏差很小，說明通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化的制備工藝所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好。根據(jù)最佳工藝條件制得的微球見圖7，粒徑分布均勻，跨距較小，微球圓整、無粘連。

圖7 優(yōu)化后制得的微球顯微鏡照(400倍)Fig.7 Micrograph of optimized microspheres

2.4 體外釋放性質(zhì)考察

3批恩諾沙星原料藥和恩諾沙星殼聚糖微球在24 h內(nèi)的釋放性測定，結(jié)果見圖8。

圖8 釋放曲線(n=3)Fig.8 The curve of release

由圖8可知，與原料藥相比，微球有明顯的緩釋效果，微球在2 h內(nèi)釋放了總藥量的32%，之后釋藥平緩，釋放變慢，24 h釋放了總藥量的84%。體外釋放數(shù)據(jù)符合 Higuchi方程，Q=0.163 9t1/2+1.248 5，R2=0.966 1。

3 結(jié)論

研究了恩諾沙星緩釋微球制備工藝條件的優(yōu)化，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法安排實(shí)驗(yàn)并對結(jié)果進(jìn)行擬合分析，以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，建立了油水相比、殼聚糖濃度和交聯(lián)時(shí)間對歸一值的二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，描繪出效應(yīng)面圖和等高線圖，進(jìn)而得到最佳制備工藝參數(shù):油水相比4.2∶1，殼聚糖濃度2%，交聯(lián)時(shí)間3.5 h。在優(yōu)化條件下制備的載藥微球粒徑、包封率、載藥量均達(dá)到了理想的效果，同時(shí)保證了樣品在24 h內(nèi)能夠有效的長時(shí)釋放藥物，從而達(dá)到良好的緩釋效果，解決了恩諾沙星半衰期較短，給藥頻繁的問題。

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